DNA倍体联合肿瘤标志物检测在胸腔积液诊断中的应用

邢应如， 胡万发， 杨路宝， 张荣波， 阮建华

胸腔积液是恶性肿瘤最常见的并发症之一，其中恶性胸腔积液的患者预后差，其中位生存期仅4个月[1]。国际肺癌研究联合会建议将伴有恶性胸水的非小细胞肺癌定于Ⅳ期[2]。故尽早明确诊断可为治疗赢得时间，改善预后及延长生存期。目前，恶性胸腔积液诊断主要依靠脱落细胞学检查，细胞学检查工作量大、效率低，且要有专业培训、有足够工作经验的临床病理专家才能做出确诊，即便如此，脱落细胞学检查诊断阳性率也仅约60%[3]。采集胸水制备单细胞悬液适合行DNA倍体流式分析；在恶性胸腔积液中的肿瘤标志物明显高于血清肿瘤标志物，测定胸水中肿瘤标志物的含量比测定血清中的更有价值。在我国，流式细胞仪和全自动化学发光仪已普及应用，且肿瘤标志物、DNA倍体分析具有定量、快速、价廉、易标准化的特点，操作简单，能广泛应用于临床。本文通过对DNA倍体分析、肿瘤标志物检测结果与细胞学检测结果的比较，探讨前两者联合的诊断价值。

1 对象和方法

1.1 研究对象 选取2010年7月至2012年12月期间，在安徽理工大学东方肿瘤医院就诊，首诊有胸腔积液的患者108例。临床确诊恶性胸腔积液68例，良性胸腔积液40例。恶性胸腔积液中，男40例，女28例；年龄37～87岁，中位年龄64岁；其中肺癌50例(腺癌35例，鳞癌10例，小细胞肺癌5例)，胃癌4例，食管鳞癌4例，肠癌2例，胆管胆囊癌2例，肝癌1例，乳腺癌2例，卵巢癌2例，宫颈鳞癌1例。良性胸腔积液中，男34例，女6例；年龄23～83岁，中位年龄50岁；其中心功能不全4例，感染性胸膜炎9例，结核性胸膜炎27例。

1.2 试剂与仪器 ARCHITECT i 2000SR全自动免疫发光分析仪、癌胚抗原(CEA) 、糖类抗原199(CA199)、糖类抗原125(CA125)、鳞癌相关抗原(SCC)试剂盒、标准液和质控品购自美国Abbott 公司；MAGLUMI 2000全自动免疫发光分析仪、神经烯醇化抗原(NSE)、细胞角蛋白19片段(CYFRA211)试剂盒、标准液和质控品购自中国深圳新产业公司；FACSCalibur型四色流式细胞仪、CaliBRITETM3 COLOR KIT(Cat No:340486) 和CaliBRITETMAPC(Cat No:340487) 定标荧光微球、BD CycletestTMPlus DNA Reagent kit (Cat No:340242)和BD MultitestTMIMK kit 四色荧光抗体试剂盒 (Cat No:340503)，BDTM DNA QC Particles Vial(Cat No:349523)购自美国Becton Dickinson公司。

1.3 DNA倍体分析 胸腔穿刺取胸水30 mL，予肝素抗凝后分别装入10 mL试管中，2 000转/min离心5 min后弃上清液。若沉淀中无红细胞，用PBS洗涤1次，2 000转/min离心5 min，弃上清液备用。若沉淀中有红细胞，则加入1 mL红细胞溶解液，振荡混匀后，避光室温下静置10 min后2 000转/min离心5 min，弃上清液，再用PBS洗涤1次，弃上清液备用。用洗涤好的细胞制成106/mL单细胞悬液。取100 μL单细胞悬液，先加入DNA倍体分析试剂盒中的细胞膜穿透液250 μL，室温孵育10 min，再加入RNA消化酶200 μL，室温孵育10 min，最后加入冷的PI染液200 μL，放入4 ℃冰箱避光孵育10 min。细胞悬液用50目细胞筛过滤后，上机检测。测定前用DNA质控试剂盒对流式细胞仪进行调整，2 μm微球峰的变异系数(CV)<2%方可测定标本。每例测定10 000个细胞，用Cell-Quest软件来获取细胞信息，以健康人外周血淋巴细胞作为二倍体标准对照，用Modfitlt软件来分析，实验结果以单参数直方图显示。报告DNA指数(DNA Index, DI)和S期细胞比率(S-phase fraction, SPF)，DI为被测标本细胞DNA含量峰值与对照二倍体峰值之比。有关肿瘤DNA倍体的分类根据1990年第14届国际分析细胞学术会议上根据DI值判断DNA倍体类型的建议：(1)二倍体(diploid, D)：DI=1.00；(2)近二倍体(near-diploid, ND)：在DNA直方图上出现2个G0/1细胞峰，其中1个G0/1细胞峰的峰位在DNA二倍体G0/1峰的峰位附近，另1个G0/1峰的DI值在0.90～1.10之间；(3)四倍体(tetraploid, T)：DI在1.90～2.10之间；(4)非整倍体(aneuploid, AN)：DI值<0.90或>1.10；(5)多异倍体(multiploid, M)：DNA直方图中，除D的G0/1细胞峰外，还有2个或2个以上异倍体细胞G0/1峰。出现后4种DNA倍体类型之一者均为DNA异倍体。

1.4 肿瘤标志物测定 胸腔积液标本3 000转/min离心5 min后，取上清液，按照仪器标准操作规程操作，定标液校准仪器，质控通过后检测标本。

2 结果

2.1 细胞学诊断 恶性肿瘤细胞胞核明显增大，核形不规则，大小不等，核染色质粗糙深染(见图1)。

图1 A：胸水中肺腺癌细胞(瑞氏染色，×100) B：胸水中胃癌细胞(瑞氏染色，×100)

2.2 DNA倍体分析 (1)异倍体分析：本研究68例恶性胸腔积液中异倍体48例，敏感性70.6%，其中四倍体5例，多倍体8例，非整倍体35例，见图2。40例良性胸腔积液2例出现异倍体，特异性95%。异倍体DI为0.74～3.36，多倍体以所占比例最大的细胞群DI计算，DI均值为1.625±0.341。(2)细胞增殖活性分析：根据倍体类型，将恶性胸水组分为异倍体阳性组(n=48)和异倍体阴性组(n=20)，与良性组(n=40)对照，统计3组的SPF，两两比较进行t′检验。结果，异倍体阳性组SPF高于异倍体阴性组，异倍体阴性组高于良性组，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表1。

图2 DNA倍体直方图

表1 异倍体阳性组、阴性组和良性组之间的SPF比较

2.3 肿瘤标志物检测 (1)良、恶性胸腔积液的6种肿瘤标志物检测结果比较见表2。除NSE外，其他5种肿瘤标志物恶性胸水的结果均显著高于良性组，差异有统计学意义(均P<0.05)。(2)ROC分析(图3、表3)：CYFRA211、CEA、CA199AUC>0.7，对良、恶性胸腔积液的鉴别有一定的准确性， CA125、SCC的AUC<0.7，有较低的准确性，NSE的AUC<0.5，无诊断价值。本实验以AUC>0.65为标准计入联合统计，SCC、NSE的准确性和敏感性低，故不计入。

表2 良、恶性胸腔积液6种肿瘤标志物结果比较

图3 6种肿瘤标志物的ROC曲线

2.4 DNA倍体分析联合4种肿瘤标志物诊断和细胞学诊断的对比 由表4可见：CEA+CYFRA211联合检测恶性胸水的敏感性是61.8%(42/68)；CEA+CYFRA211+CA199联合检测的敏感性是73.5%(50/68)，CA199+CEA+ CYFRA211+ CA125联合检测的敏感性是79.4%(54/68)，特异性均是100%。肿瘤标志物联合检测的敏感性明显高于单项检测。肿瘤标志物与DNA倍体联合检测：CYFRA211与DNA倍体联合检测的敏感性是77.9%(53/68)，CEA+CYFRA211与DNA倍体联合检测的敏感性是82.4%(56/68)，CEA+CA199+CYFRA211与DNA倍体联合检测的敏感性是86.8%(59/68)，CEA+CA199+CYFRA211+CA125与DNA倍体联合检测的敏感性是88.2%(60/68)，可检出63.6%细胞学阴性的恶性胸水，显著高于细胞学诊断。

表3 6种肿瘤标志物的ROC分析的COV、敏感性、特异性和Youden’s指数

表4 DNA倍体联合4种肿瘤标志物检测敏感性与细胞学检查结果的比较

3 讨论

生物学研究发现非增殖状态下细胞DNA 含量稳定，为二倍体，当细胞进入分裂期时细胞DNA含量增加，在DNA合成后期，DNA含量倍增。而在病理状态下，尤其是癌变的细胞，染色体的结构和数目发生异常，出现DNA异倍体，故测定细胞DNA含量可用来判定细胞的正常或异常。

本研究用流式细胞仪检测108例胸腔积液中的脱落细胞，DNA异倍体的敏感性为70.6%，特异性为95%，ROC曲线分析AUC为0.828，对良恶性胸腔积液有一定的诊断价值。近年来国内外研究发现，流式细胞仪DNA倍体检测恶性积液的敏感性为41.7%～91.0%[3-4]，我们的检测结果与此相似。在良性胸水DNA倍体测定中，出现假阳性2例，DI均<1，涂片提示大量退化细胞，分析原因可能是胸腔积液中细胞破坏、染色体丢失所致，另外反应性间皮细胞增生、染色体一过性畸变和数据分析误差等原因也可导致假阳性。文献报道DNA倍体检测恶性积液的敏感性差别较大，分析出现假阴性的原因可能为：(1)原发肿瘤为两倍体肿瘤，且转移灶与原发灶有同源性；(2)少量恶性细胞的异倍体峰被大量组织细胞所形成的二倍体细胞峰掩盖；(3)少量的染色体变异不能被流式细胞仪所识别；(4)大量间皮细胞稀释恶性细胞，导致异倍体峰缺失；(5)染色体的机械缺失和复制中的错误相平衡而表现为两倍体；(6)肿瘤细胞未脱落至浆膜腔以及存在高分化的二倍体肿瘤等因素有关。

S期细胞比率(SPF)是反应细胞增殖活性的细胞动力学参数，本研究表明恶性胸水中的异倍体细胞SPF明显高于异倍体阴性的恶性胸水细胞和良性胸水细胞，说明胸腹水中恶性肿瘤细胞增殖活性较高。王书奎等[5]研究表明，肿瘤细胞增殖活性，从D →ND →T →AN →M，其SPF和增殖指数PI均逐渐升高，DNA异倍体肿瘤患者的生存率及平均生存期均显著低于二倍体肿瘤，DNA异倍体与肿瘤的恶性程度密切相关。Zabotto等[6]研究了271例无淋巴结转移的Ⅰ到Ⅱ期乳腺癌患者，发现异倍体肿瘤的SPF值明显高于二倍体肿瘤(P=0.0001)，高SPF值与低无瘤生存率相关，高SPF值和异倍体的患者预后较差。Kleinbergl等[7]研究原发性卵巢癌(化疗前)和积液(14例化疗前，8例化疗后)的DNA倍体情况，认为积液肿瘤中SPF值明显高于原发肿瘤，较高的SPF值与高Ki-67积分相关(P=0.045)，积液中的卵巢癌细胞同相应的原发肿瘤比较增值活性增加，可作为疾病进展的证据，化疗没有改变积液中癌细胞的DNA倍体参数，DNA倍体参数与化疗反应和生存无关。

在恶性胸腔积液患者中，恶性肿瘤侵犯胸膜，癌细胞增殖、合成和直接释放肿瘤标志物至胸腔内的量明显增加，由于此类标志物大都分子量较大，一旦在闭合胸膜腔内产生，便不易进入血液循环中，而即使进入血清中的肿瘤标志物也易被肝脏灭活，致使其胸水浓度明显高于血清浓度。而一旦血清内肿瘤标志物水平明显升高，则可推断肿瘤标志物已大量吸收入血，疾病进入中晚期阶段，失去了早诊断、早治疗的机会。因此测定胸水中肿瘤标志物的含量，能为恶性胸腔积液患者的早诊断、早治疗争取宝贵的时间，比测定血清中的含量更有价值。目前胸腔积液中肿瘤标志物的检测在临床上开展的并不理想，远不及其在血清中开展的广泛，主要原因是积液中肿瘤标志物的检测研究还不透彻，没有权威杂志、书籍的总结推广。本研究应用ROC曲线分析6种肿瘤标志物对良恶性胸腔积液的诊断准确性，结果显示单项检测敏感性较低，联合检测可明显提高对恶性胸水的诊断率。陶绍能等[8]研究认为CEA+CA199诊断恶性胸腔积液方式最佳，灵敏度和特异度可达到93.3%和80%。Shitrit等[9]研究指出恶性胸水检查首选CEA检测，CA153和CYFRA211可作为备选检查，高浓度的CEA和(或)高浓度的CA153和CYFRA211应高度怀疑为恶性积液。我们研究发现DNA倍体分析联合多项肿瘤标志物检测可明显提高检测的敏感性，DNA倍体联合CEA、CA199、CYFRA211和CA125检测是最佳组合，其敏感性为88.2%(60/68)，特异性95.0%，可检出63.6%细胞学阴性的恶性胸腔积液。

总之，流式细胞DNA异倍体检测对于恶性胸腔积液的诊断具有良好的临床价值，DNA倍体联合CEA、CA199、CYFRA211和CA125检测是最佳组合，而NSE、SCC检测对判断恶性胸腔积液的小细胞肺癌和鳞状上皮细胞癌来源有一定意义。DNA异倍体联合肿瘤标志物检测具有定量、快速、价廉、易标准化的特点，操作简单，适合临床推广应用。

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