Cks1在老年肝细胞癌中的表达及临床意义

张秀梅， 顾金松， 刘 曙， 孙成福， 谭 进

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的肝脏原发性恶性肿瘤，全世界每年大约有100万人死于肝癌，其中老年人是高发人群。尽管手术切除和肝移植已经显著改善了小肝癌及无转移肝癌患者的生存时间，但是晚期肝癌患者的预后仍然较差[1]。细胞周期蛋白依赖性激酶调节亚基1(cyclin kinase subunit 1，Cks1)是高度保守的细胞周期调节蛋白Suc1/Cks蛋白家族成员之一，目前已经有大量的研究表明Cks1在多种肿瘤的病理组织中(包括胃癌、乳腺癌和肝癌等)高表达，并发挥着一定的生物学功能[2-4]。本研究采用免疫组化SP法检测Cks1在老年肝细胞癌及对应癌旁组织中的表达，分析其在肝细胞癌及对应癌旁组织中的表达水平及其与临床病理特征的联系，探讨其在老年肝细胞癌诊治方面的意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 肝癌及对应癌旁组织来源于本院2011年6月至2013年3月期间住院肝癌患者的手术切除标本，共60例。其中男33例，女27例，年龄61～80岁，平均年龄(71.12±3.20)岁。HBV感染32例(53.3%)，肝硬化38例(63.3%)，瘤体积≥5 cm有34例(56.7%)，肝内发生转移31例(51.7%)。所有患者术前均未行放疗、化疗及射频消融治疗，所有组织标本经术后病理学证实为肝细胞癌。所有标本于术中离体30 min内取材，经10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋、切片备用。HCC组织根据Edmondson标准分级：Ⅰ级12例；Ⅱ级21例；Ⅲ级12例；Ⅳ级15例。

1.2 检测方法 免疫组化SP法检测肝癌及对应癌旁组织中Cks1的表达。鼠抗人Cks1单克隆抗体(sc-376663)购自美国SANTA CRUZ公司；免疫组化试剂盒购自南京生兴生物技术有限公司。对石蜡块进行4 μm连续切片制片。蜡块脱蜡后枸橼酸盐缓冲液进行热抗原修复，然后30% H2O2室温孵育15 min后，滴加山羊血清封闭孵育20 min，再以1∶100比例稀释的Cks1一抗加于标本后，置于湿盒内4 ℃过夜。阴性对照以PBS取代一抗。滴加生物素标记的山羊鼠工作液，37 ℃温箱孵育30 min。滴加辣根酶(HRP)标记的链霉卵白素工作液，孵育30 min。滴加DAB显色，苏木素轻度复染，梯度脱水至透明。显微镜下观察，成像系统拍照，统计分析实验结果。

1.3 结果判定 用染色强度联合阳性细胞百分比进行评分。染色强度分为4等级：0分，阴性；1分，弱阳性；2分，中度阳性；3分，强阳性。阳性细胞百分比分级：阳性细胞≤5%=0分，6%～25%=1分，26%～50%=2分，51%～75%=3分，>75%=4分。染色强度和阳性细胞百分比评分相乘≥1分认为Cks1蛋白阳性表达。计数每一强度的视野数，根据下列计算公式计算每张切片的平均染色强度：IS(intensity score)=Σ{(0×F0)+(1×F1)+(2×F2)+(3×F3)}，F=%×10视野[5]。

1.4 统计学分析 所有数据采用SPSS13.0统计软件进行分析，全部资料均为二分类资料，组间比较采用χ2检验，相关分析采用Spearman相关分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Cks1与性别、HBV感染、肝硬化的关系 肝细胞癌中Cks1的阳性表达与患者的性别、有无HBV感染、有无肝硬化以及肿瘤的大小无关，均P>0.05，见表1。

表1 Cks1表达与性别、HBV感染、肝硬化及肿瘤大小的关系

2.2 肝癌及对应癌旁组织中Cks1表达的对比 Cks1在肝细胞癌组织中的阳性表达率为71.7%(43/60)，显著高于对应的癌旁组织的20.0%(12/60)，差异有统计学意义(χ2=32.26，P<0.001)，提示Cks1在肝细胞癌组织中高表达，在癌旁组织中低表达，Cks1可以作为肝细胞癌组织的诊断指标。见表2。

2.3 Cks1表达强度与肝癌组织病理参数的相关性由表3可见，Cks1蛋白表达强度与肝细胞癌分化程度显著相关(r=0.817，P<0.05)，癌细胞分化愈差，Cks1蛋白表达愈弱；而Cks1蛋白表达强度与癌旁组织的分化程度无关(r=0.112，P>0.05)。

3 讨论

细胞周期抑制蛋白p27低表达与多种肿瘤的预后不良相关，p27蛋白通过泛素蛋白酶体途径降解，泛素连接酶Sphase kinase protein2(SKP2)负责识别p27，但SKP2只有结合Cks1之后才能识别p27并导致其泛素化降解[6]。研究认为Cks1的表达与肿瘤分化程度和患者的生存期显著相关，Cks1在结、直肠癌中的表达与肿瘤的分化程度及p27的表达呈显著负相关[7]，而在胃癌中Cks1同样高表达，并且与肿瘤分化程度相关[8]。因此我们推测，Cks1在多种恶性肿瘤中存在异常高表达。其在细胞周期的调节中具有重要作用。

肝癌恶性程度高，临床症状隐匿，预后较差，目前尚缺乏完全反应其生物学特性的临床指标。本研究通过检测Cks1在老年肝细胞癌及对应癌旁组织中的表达，探讨其在老年肝细胞癌及其癌旁组织中的诊治意义。结果发现，Cks1在肝细胞癌组织中的阳性表达水平显著高于对应的癌旁组织，其表达程度与肝癌Edmonson分级显著相关。提示了Cks1的阳性表达程度与肝癌的增殖能力和恶性程度有着密切的联系，Cks1在肝癌的发生发展中可能起着重要的协同作用。

总之，Cks1在肝细胞癌的发生、发展中起重要作用，检测老年肝癌组织中的Cks1表达情况对患者的预后预测和临床个体化治疗具有一定的指导意义。

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