革兰氏染色技术的实验研究

　　摘 要： 作者经过对比试验，研究了菌龄、涂片厚度、媒染时间、脱色时间的变化对革兰氏染色结果的影响。结果表明：革兰氏染色时，大肠杆菌培养24h左右为宜，而枯草芽孢杆菌培养15h左右为宜；涂片厚度应均匀薄片；媒染时间控制在60s；脱色时间应严格控制在25～30s。
　　关键词： 大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 革兰氏染色 影响因素
　　革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种重要的鉴别方法，而实验成功率低，常常出现假阳性或假阴性的结果，对初学者来说难度较大。因此，我们选取大肠杆菌作为G代表，枯草芽孢杆菌作为G代表，分析影响革兰氏染色结果的各种因素，提高染色结果的准确性。
　　1.实验材料
　　1.1菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。
　　1.2试剂：草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、番红染液。
　　2.实验方法和结果
　　2.1菌龄对染色结果的影响
　　革兰氏染色要求菌种被染色时处于活跃生长期。大肠杆菌的活跃生长期为24h左右，枯草芽孢杆菌活跃生长期为在14～16h，故对不同培养时间的菌种分别选择10个时间段进行革兰氏染色观察。实验结果见表1。
　　由表1可见，培养时间对染色结果影响较大，不同菌种对培养时间有不同要求。处于活跃生长期的菌体细胞结构最为典型，能正确反映染色的结果。其中，大肠杆菌培养24h左右为宜，而枯草芽孢杆菌培养15h左右为宜。
　　2.2涂片厚度对染色结果的影响
　　用直径3mm的接种环分别挑起培养24h左右的大肠杆菌和培养15h左右的枯草芽孢杆菌满环、半环、更少量涂片，从中央向外围涂开，使细菌在一小滴生理盐水中涂成直径约1cm的菌膜，堆积密度由浓厚到均匀分散，作革兰氏染色观察。结果显示：涂片浓厚时，大肠杆菌因密集脱色不完全而呈阳性反应，枯草芽孢虽呈阳性但是染色均匀度欠佳；涂片太薄，菌体过于稀少，观察时寻找视野较麻烦。因此，只有在菌膜厚度均匀分散、肉眼能见无菌生理盐水稍显浑浊时，才能得到较佳的染色结果。
　　2.3媒染时间对染色结果的影响
　　将培养24h左右的大肠杆菌和培养15h左右的枯草芽孢杆菌革兰氏染色，碘液作为媒染剂，覆盖时间分别为30s、60s、90s、120s。实验结果见表2。
　　由表2可见，媒染时间过短，不利于结晶紫—碘的复合物与细胞之间的结合，可能造成枯草芽孢杆菌（G）呈假阴性的结果，但对大肠杆菌（G）无影响；反之，媒染时间过长，结合过于牢固，容易造成大肠杆菌（G）假阳性的结果，但对枯草芽孢杆菌（G）影响非常小。因此，媒染时间应控制在60s为宜。
　　2.4乙醇脱色对染色结果的影响
　　脱色是影响革兰氏染色的关键步骤，脱色时间直接关系到染色结果的准确性。我们选择10s至60s的脱色范围，分6个时间分别进行实验。实验结果见表3。
　　由表3可见，脱色程度不够，大肠杆菌（G）可被染成假阳性，对枯草芽孢杆菌（G）影响较小；脱色过度，枯草芽孢杆菌（G）容易成假阴性，对大肠杆菌（G）影响较小。这是由于酒精脱色时间长使得细胞壁中脂类物质易被溶解，细胞通透性增大，导致结晶紫—碘复合物易被抽提出来；反之，脱色时间短，复合物就不易从细胞壁中逸出，而两种菌种化学组成有差别，染色受影响程度不一样。因此，革兰氏染色时，一定要严格控制酒精脱色时间，一般以25～30s为宜。
　　3.结果分析
　　通过以上实验和分析，我们认为菌龄、细菌密集程度、媒染时间、酒精脱色程度这几个因素都会影响革兰氏染色结果的正确性，同时还受干燥、固定等操作的影响。因此在进行革兰氏染色实验教学和科研工作中，除操作正确适当外，更重要的是选择适合的菌龄和准确把握脱色时间，这样才能保证染色结果的正确性。
　　参考文献：
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