不同产地南方红豆杉枝叶的紫杉醇含量及其指纹图谱的比较分析

柏培磊，孙启武，蒋继宏，闫 浩，于少帅，张小平，①

（1.安徽师范大学重要生物资源保护与利用研究安徽省重点实验室生物环境与生态安全安徽省高校省级重点实验室，安徽 芜湖 241000；

2.中国林业科学研究院林业研究所国家林业局林木培育重点实验室，北京 100091；3.江苏省药用植物生物技术重点实验室，江苏 徐州 221116）

南方红豆杉〔Taxus chinensis var.mairei（Lemée et Lévl.）Cheng et L.K.Fu〕又称美丽红豆杉，属常绿植物，为国家一级保护植物，是红豆杉属（Taxus L.）中分布最广、生长最快的种类之一［1］。南方红豆杉主要分布于长江流域以南各省区、南岭山脉山区以及河南和陕西等省的山地或溪谷［2］，安徽黄山是野生型南方红豆杉重要的自然分布区之一。

自Wani等［3］从短叶红豆杉（T.brevifolia Nutt.）中分离得到抗癌药物紫杉醇并揭示其化学结构以来，近年来有关红豆杉属植物紫杉醇含量的研究已成为国内外学者的研究热点［4－7］；目前对南方红豆杉的研究主要集中在化学成分、药理作用、繁殖技术、居群多样性等方面［8－11］，而关于红豆杉化学成分指纹图谱的研究报道较少，仅见少数学者关于东北红豆杉（T.cuspidata Sieb.et Zucc.）枝叶、南方红豆杉人工林药材活性成分及南方红豆杉三氯甲烷提取物的指纹图谱［12－14］的研究报道，但是由于供试样品都来自同一省份，不具有代表性，因此无法针对南方红豆杉的化学成分建立完整、全面的指纹图谱。

为了全面反映南方红豆杉的化学成分，确立较完善的南方红豆杉质量评价系统，作者对来源于6个产地的12个南方红豆杉枝叶样品中紫杉醇含量和不同产地指纹图谱的相似度进行了比较，初步建立了野生南方红豆杉的特征指纹图谱，并结合环境因子讨论了导致不同产地南方红豆杉枝叶中紫杉醇含量差异的因素，以期为南方红豆杉优良种源的选育以及药材种植基地进行质量控制提供科学研究依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试南方红豆杉枝叶样品于2009年10月至11月分别采自陕西周至县和汉中市、甘肃天水市、安徽胡乐镇、聂家山和仙寓山，均为野生植株，由安徽师范大学生命科学学院张小平教授鉴定；每个产地随机选择胸径相近的样株2株，每株为1个样品；因南方红豆杉中紫杉醇含量与植株性别无关［15］，故采样时不考虑性别因素。随机采集样株上的枝叶，置于50℃烘箱中干燥24 h后粉碎，过40目筛，待用。

主要仪器：岛津LC20A高效液相色谱仪（日本岛津公司）、KQ－500DE型医用数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、FA2004A电子分析天平（上海精天仪器有限公司）、RE52－CS旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、80－2离心机（江苏省荣华仪器制造有限公司）、DFY－250粉碎机（温岭市林大机械有限公司）和Milli－Q Academic密理博纯水器（美国MILLIPORE公司）。

所用试剂：乙腈和甲醇（色谱纯，购自美国迪马公司），超纯水，其余试剂均为分析纯；紫杉醇标准品购自桂林晖昂生化药业有限责任公司（产品编号JF20090301，纯度99.9％）。

1.2 方法

1.2.1 HPLC 色谱分析条件 采用汉邦C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）。流动相为乙腈和水，梯度洗脱，具体操作流程为：0～20 min，V（水）∶V（乙腈）=85∶15～50∶50；20～50 min，V（水）∶V（乙腈）=50∶50～0∶100；50～60 min，V（水）∶V（乙腈）=0∶100。流速0.8 mL·min－1，进样量5μL，洗脱时间60 min，检测波长227 nm。

1.2.2 标准品溶液制备及标准曲线绘制 精密称取紫杉醇标准品50 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL，作为紫杉醇标准品母液。用甲醇将紫杉醇标准品母液分别稀释成质量浓度为0.2、0.1、0.05、0.025和0.005μg·mL－1的系列标准品溶液，按照上述色谱条件进样分析。以峰面积为纵坐标（Y）、紫杉醇标准品的质量浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，获得的线性回归方程为Y=12016277.6679X－13201.9028（r=1.0000），表明在质量浓度0.005～0.2μg·mL－1内具有良好的线性关系。

1.2.3 供试样液的制备和测定 精密称取2 g样品粉末，室温下加20 mL体积分数95％乙醇浸泡24 h后超声处理2 h；4000 r·min－1离心5 min，上清液过滤，沉淀分别用体积分数95％乙醇超声提取2次，每次30 min，均经4000 r·min－1离心5 min，上清液过滤；合并3次滤液，置于旋转蒸发仪中蒸干；然后用V（三氯甲烷）∶V（水）=1∶1混合溶剂10 mL进行萃取，重复萃取3次，合并三氯甲烷相萃取液，用旋转蒸发仪于35℃蒸干；浸膏用甲醇溶解并定容至10 mL，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液即为供试样液。参照上述色谱条件进行HPLC分析，进样量5μL。采用外标法计算紫杉醇含量。

1.2.4 方法学考察

1.2.4.1 精密度实验 取甘肃天水2号供试样液，按上述色谱条件进样分析，连续进样5次，每次进样量5μL。各色谱峰相对保留时间及峰面积比值基本一致，RSD值均小于3％，表明该方法精密度良好，符合指纹图谱检测要求。

1.2.4.2 稳定性实验 取陕西汉中2号供试样液，按上述色谱条件分别在0、2、4、6、8和24 h进样分析，进样量5μL。各色谱峰相对保留时间及峰面积比值基本一致，RSD值均小于5％，表明供试样液在24 h内稳定。

1.2.4.3 重现性实验 取甘肃天水1号样品粉末5份，按上述提取方法制备供试样液，并按上述色谱条件进样分析，进样量5μL。各色谱峰相对保留时间及峰面积比值基本一致，RSD值均小于3％，表明该方法的重现性良好，符合指纹图谱检测要求。

1.2.4.4 参照峰的确定 分别取适量紫杉醇标准品和样品溶液，按上述色谱条件进样分析。通过标准品与样品色谱图的对照，确定参照峰（s）。

1.3 数据处理和分析

采用“中药色谱图分析和数据管理系统”软件对各样品的指纹图谱进行比较，并构建南方红豆杉的特征指纹图谱；以陕西周至1号样品指纹图谱为基准，采用相关系数法和夹角余弦法分别计算其他样品指纹图谱与之的相似度。

2 结果和分析

2.1 不同产地南方红豆杉紫杉醇含量的比较

采用外标法计算12个南方红豆杉枝叶样品的紫杉醇含量，并得出同一产地紫杉醇含量的平均值。结果表明：来源于陕西周至的南方红豆杉枝叶中紫杉醇含量最高，平均为0.0193 mg·g－1；来源于陕西汉中的南方红豆杉枝叶样品中紫杉醇含量也较高，平均为0.0165 mg·g－1；来源于甘肃天水的样品中紫杉醇含量居中，平均为0.0115 mg·g－1；来源于安徽省3个产地的样品中紫杉醇含量均较低，采自胡乐、聂家山以及仙寓山的样品中紫杉醇的平均含量分别为0.0059、0.0070和0.0025 mg·g－1。

2.2 不同产地南方红豆杉指纹图谱中共有峰的标定及分析

采用“中药色谱图分析和数据管理系统”软件对6个产地12个南方红豆杉枝叶样品的指纹图谱进行分析和比较，共确定了12个共有色谱峰；根据标准品与样品色谱图的对照（图1），发现样品指纹图谱中保留时间为32.75 min的色谱峰与紫杉醇标准品的色谱峰保留时间一致，且分离度良好，因此，选定此峰为南方红豆杉指纹图谱的参照峰（s），即编号为9的共有峰。

图1 紫杉醇标准品与南方红豆杉枝叶样品色谱图的比较Fig.1 Com parison of chromatogram s of taxol standard and sam ple of branch and leaf of Taxus chinensis var.mairei（Lemée et Lévl.）Cheng et L.K.Fu

设定参照峰的保留时间和峰面积为1，并据此计算其他共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表1和表2。分析结果表明：不同样品12个共有峰相对保留时间的RSD值均小于1％，说明各共有峰的保留时间稳定，可以确定共有峰的存在；但是，12个样品各共有峰相对峰面积的RSD值均大于40％，说明各共有峰的相对含量差异较大，这一现象可能与样品的差异有关。

表1 不同产地南方红豆杉枝叶样品指纹图谱共有峰的相对保留时间Table1 Relative retention time of common peaks in fingerprint of samples of branch and leaf of Taxus chinensis var.mairei（Lemée et Lévl.） Cheng et L.K.Fu from different locations

表2 不同产地南方红豆杉枝叶样品指纹图谱共有峰的相对峰面积Table2 Relative peak area of common peaks in fingerprint of sam ples of branch and leaf of Taxus chinensis var.mairei（Lemée et Lévl.）Cheng et L.K.Fu from different locations

2.3 不同产地南方红豆杉指纹图谱的相似度分析和特征指纹图谱的建立

根据6个产地12个南方红豆杉枝叶样品的色谱图建立的南方红豆杉的特征指纹图谱见图2。其中，S1～S12为各样品的色谱图，R为根据12个样品的色谱图分析结果建立的南方红豆杉特征指纹图谱。

图2 不同产地南方红豆杉枝叶样品的指纹图谱及其特征指纹图谱Fig.2 Fingerprint of samples of branch and leaf of Taxus chinensis var.mairei（Lemée et Lévl.）Cheng et L.K.Fu from different locations and its characteristic fingerprint

以陕西周至1号样品（S1）的色谱图为基准，分别将其他样品的色谱图与之比较，得到各样品的相似度值，详见表3。结果表明：除了安徽聂家山2个样品的相似度值较低外，其余样品的相似度均较高，相似度值均大于0.8，说明12个共有峰在各样品中均能稳定出现，吻合度较好。由此可以确定：图2中的南方红豆杉枝叶的特征指纹图谱（R）可用于南方红豆杉真伪的鉴别。

表3 不同产地南方红豆杉枝叶样品指纹图谱的相似度分析1）Table3 Sim ilarity analysis of fingerprint of samples of branch and leaf of Taxus chinensis var.mairei（Lemée et Lévl.）Cheng et L.K.Fu from different locations1）

3 讨论和结论

南方红豆杉枝叶成分复杂，因而，采用适宜的提取分离及分析方法才能使其指纹图谱能全面反映南方红豆杉的化学成分。为此，作者在前期研究中对样品的提取溶剂、洗脱剂及流速进行了优化。其中，采用体积分数95％的乙醇超声提取，色谱峰数量较多、分离度和重现性较好；采用乙腈和水（体积比）梯度洗脱系统可以很好地分离各种成分，能提供丰富的色谱信息，且简单易制；而采用0.8 mL·min－1的流速，则各成分峰的分离程度好且峰形好。因此，在本研究中作者均采用了优化的提取及色谱分析条件。

王朝晖等［16］的研究结果表明：南方红豆杉中紫杉醇含量在6月份达到最大值，然而6月份容易发生洪涝，土壤含水量长期过多可能在一定程度上抑制根系的呼吸作用，从而影响南方红豆杉的生长并间接影响紫杉醇的积累。植物次生代谢产物的产生是植物在长期进化过程中适应生态环境变化的结果，许多植物在受到病虫害的侵染或环境胁迫后能够产生并积累大量的次生代谢产物，以增强自身的免疫力和抵抗力。Paolini等［17］的研究结果表明：萜类化合物可以吸引传粉者和食草动物，帮助植物进行花粉传播，而且在抗氧化和耐热性调节以及防御微生物和害虫等方面有重要作用。作者的研究结果表明：不同产地南方红豆杉枝叶中紫杉醇含量差异较大，推测这一差异可能与生长环境有关。来源于陕西和甘肃的样品中紫杉醇含量较高，而来源于安徽3个产地的样品中紫杉醇含量均较低，其原因可能是陕西和甘肃属于温带季风气候，夏季高温少雨、冬季寒冷干燥；而安徽属于亚热带季风气候，夏季高温多雨、冬季温和少雨。夏季的高温少雨容易造成土壤干旱，从而引发水胁迫致使南方红豆杉体内的紫杉醇合成途径开启以加强其自身的防御能力。

相似度分析结果表明：除了安徽聂家山的2个样品外，其他样品指纹图谱的相似度值均大于0.8，说明供试12个样品的指纹图谱中主要峰群的整体特征基本一致，但由于各化学成分相对峰面积的RSD值都大于40％，差异主要表现在峰高上，并且产地相近的样品指纹图谱的相似度并不接近，导致样品间的指纹图谱不完全一致，说明不同产地的样品中各成分含量的差异较大。药用植物的化学组成受外界环境（如生长环境、土壤性质）及遗传因素等方面的影响［18］，使植物体内的成分和含量有所不同，在HPLC色谱图上则表现为某些峰的差异以及相似保留时间上峰面积的差异。

通过本研究获得的6个产地野生南方红豆杉枝叶化学成分的指纹图谱与杨水平等［13］的研究结果差异较大，共有峰数量明显减少，指纹图谱的相似度也有差异。造成这种差异的原因可能是由于本研究中的供试样品均为野生植株，且来源于不同产地，生长环境差异较大；而后者的研究样品来自同一种植基地，气候和土壤环境差异不大。由于作者的测定结果具有明显的产地差异，因此，获得的特征指纹图谱不但具有一定的代表性，也更能全面反映南方红豆杉的化学成分特征，对南方红豆杉药材质量控制具有一定的参考价值。

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