桔梗多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠的免疫调节

贾 林 陆金健 周文雅 施佳杰 沃兴德

（浙江中医药大学生命科学学院，浙江 杭州 310053）

桔梗多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠的免疫调节

贾 林 陆金健 周文雅 施佳杰 沃兴德

（浙江中医药大学生命科学学院，浙江 杭州 310053）

研究桔梗多糖（PPS80）对环磷酰胺（CTX）所致免疫抑制小鼠的免疫调节作用。将60只雄性KM小鼠随机分为正常组、模型组、桔梗多糖低、中、高剂量治疗组（100，200，400mg／（kg·d））和盐酸左旋咪唑（LMS）阳性组。连续3d腹腔注射环磷酰胺80mg／（kg·d）建立免疫抑制小鼠模型，于给药治疗1周后利用称重法检测胸腺指数和脾脏指数，ELISA法测定血清白介素－2（IL－2）和肿瘤坏死因子－α（TNF－α）含量。结果表明，桔梗多糖能明显增加环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠的胸腺指数和脾脏指数，显著提高血清中IL－2和TNF－α的含量并呈剂量依赖性。桔梗多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠具有免疫增强调节作用。

桔梗；多糖；免疫增强；白介素－2；肿瘤坏死因子－α

中药桔梗为桔梗科（campanulaceae）植物桔梗（Platycodon grandiflorumA.DC）的干燥根，味苦、辛，平，用于咳嗽痰多、胸闷不畅、咽痛音哑、肺痈吐脓［1］，现代研究［2］显示其具有降血糖、降血脂、镇痛镇静、抗炎、抗过敏、抗肿瘤、扩张血管、抗氧化等功效。多糖作为桔梗的主要化学成分之一，文献［3］报道其在体外能清除羟基自由基和超氧阴离子自由基，并对细胞水平具有一定的免疫调节作用［4－6］。笔者［7］曾通过对桔梗饮片热水浸提、乙醇分步沉淀、Sevage法脱蛋白提取得到了桔梗多糖PPS80。本试验旨在进一步明确PPS80对环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）所致免疫抑制小鼠的影响，为深入研究和开发桔梗多糖提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

桔梗饮片：浙江中医药大学中药饮片厂；

KM小鼠：雄性清洁级，上海斯莱克实验动物有限责任公司。动物生产许可证号：SCXK（沪）2007——0005；

氯化钠注射液：杭州民生药业集团有限公司；

盐酸左旋咪唑（LMS）：日本东京化成工业株式会社；

环磷酰胺（CTX）：中国Sigma公司；

Mouse IL－2ELISA试剂盒：美国ADL公司；

Mouse TNF－αELISA试剂盒：美国ADL公司；

正丁醇、硫酸等：分析纯，华东医药股份有限公司。

1.2 主要仪器

微量振荡器：MH－2型，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；

恒温金属浴：CHB－100型，杭州博日科技有限公司；

电子分析天平：AE240型，上海梅特勒－托利多仪器有限公司；

高速冷冻离心机：CR21GⅢ型，日本日立公司；

多功能酶标仪：Spectra Max M3型，美国Dynex公司。

1.3 试验方法

1.3.1 桔梗多糖的制备 桔梗饮片60℃烘干、捣碎，过60目筛，加10倍量的蒸馏水80℃回流5次，每次2h，合并水提液，过滤，浓缩。先加入95%乙醇使乙醇的终体积分数达到60%，4℃静置10h后，3 000r／min离心10min，合并上清液；继续加入95%乙醇，使乙醇的终体积分数达到80%，4℃静置10h后，3 000r／min离心10min；按Sevage法脱蛋白，于MD44－3500透析袋中蒸馏水透析48h，浓缩烘干得PPS80［7］，苯酚－硫酸法检测糖含量为85.01%［8］。

1.3.2 动物分组及给药 60只雄性清洁级KM小鼠，体重18～22g。先适应性饲养3d，然后随机分为2组：正常组12只，造模组48只。按文献［9］制备免疫抑制小鼠模型，即造模组连续3天腹腔注射CTX 80mg／（kg·d），正常组腹腔注射等体积氯化钠注射液，于第4天每组各取3只检测造模效果。造模成功后造模组随机分为5组，每组9只：PPS80低、中、高剂量治疗组分别腹腔注射100，200，400mg／（kg·d）PPS80溶液，阳性组灌胃80mg／（kg·d）LMS溶液，模型组腹腔注射等体积氯化钠注射液，连续给药1周。正常组每天腹腔注射等体积氯化钠注射液。所有药物均以氯化钠注射液现配现用。

1.3.3 胸腺指数和脾脏指数的测定 末次给药24h后，精确称重，颈椎脱臼处死小鼠，立即分离出胸腺和脾脏并称重，以胸腺或脾脏（mg）和体重（g）的比值表示小鼠的胸腺和脾脏指数。

1.3.4 血清IL－2和 TNF－α含量的检测 末次给药24h后，摘除眼球取血，1 000×g离心10min取血清，采用双抗夹心 ABC－ELISA法测定血清IL－2和 TNF－α含量，严格按照试剂盒说明书步骤操作，即酶标包被板分设为空白孔、标准孔和待测血清样品孔，空白孔加标准品稀释液50μL，标准孔依次加1 200，600，300，150，75ng／L的标准品溶液50μL，样品孔先加样品稀释液40μL，再加各待测血清10μL，37℃温育30min，每孔加入200μL以蒸馏水稀释30倍的浓缩洗涤液洗板，静置30s后弃去，重复5次，拍干。除空白孔外每孔加入酶标试剂50μL，37℃温育30min，同样操作洗板5次后拍干，每孔先加入显色剂A 50μL，再加显色剂B 50μL，轻震混匀，37℃避光显色15min，每孔加50μL终止液终止反应。以空白孔调零，于450nm波长处检测吸光度，根据浓度标准曲线计算血清IL－2和TNF－α含量。

1.4 统计方法

所有数据均采用 Microcal origin 6.0软件进行统计分析，计量资料采用±s表示，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 造模效果评价

造模组连续3天腹腔注射CTX 80mg／（kg·d）后，随即各取正常组与造模组3只分离出胸腺和脾脏。与正常组相比，造模组小鼠的胸腺和脾脏均明显减小，胸腺指数和脾脏指数均明显降低，说明造模组小鼠免疫功能受到显著抑制。

2.2 胸腺指数和脾脏指数的测定

模型组胸腺指数和脾脏指数均比正常组低（P＜0.01），与模型组比较，高剂量PPS80可提高免疫抑制小鼠胸腺指数（P＜0.05），中、高剂量PPS80均可显著增加免疫抑制小鼠脾脏指数（P＜0.01），且高剂量PPS80对免疫抑制小鼠脾脏指数的影响作用强于阳性对照LMS（表1）。

表1 PPS80对免疫抑制小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响 Table 1 Effects of PPS80on thymus and spleen index in modle mice induced by CTX（± s， n＝9）

表1 PPS80对免疫抑制小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响 Table 1 Effects of PPS80on thymus and spleen index in modle mice induced by CTX（± s， n＝9）

＊.与正常组比较P＜0.01；＃.与模型组比较P＜0.05；＃＃.与模型组比较P＜0.01。

组别 剂量／（mg·kg－1·d－1）胸腺指数／（mg·g－1）脾脏指数／（mg·g－1）－ 2.071±0.112 5.099±0.357模型组 － 1.185±0.017＊ 2.767±0.178＊PPS80（低） 100 1.245±0.049 3.325±0.283＃PPS80（中） 200 1.288±0.016 3.492±0.306＃＃PPS80（高） 400 1.314±0.006＃ 3.884±0.494＃＃LMS阳性组 80 1.438±0.005＃＃ 3.651±0.037正常组＃＃

2.3 血清IL－2含量的检测

模型组血清IL－2含量远低于正常组（P＜0.01），与模型组比较，低、中剂量PPS80均可提高免疫抑制小鼠血清IL－2含量（P＜0.05），高剂量PPS80可显著增加免疫抑制小鼠血清IL－2含量（P＜0.01），如表2所示。

表2 PPS80对免疫抑制小鼠血清IL－2含量的影响 Table 2 Effects of PPS80on concentrations of IL－2in serum of modle mice induced by CTX（± s， n＝9）

表2 PPS80对免疫抑制小鼠血清IL－2含量的影响 Table 2 Effects of PPS80on concentrations of IL－2in serum of modle mice induced by CTX（± s， n＝9）

＊.与正常组比较P＜0.01；＃.与模型组比较P＜0.05；＃＃.与模型组比较P＜0.01。

组别 剂量／（mg·kg－1·d－1） IL－2含量／（μg·L－1）2.595±0.195模型组 － 2.024±0.044＊PPS80（低） 100 2.354±0.119＃PPS80（中） 200 2.355±0.121＃PPS80（高） 400 2.425±0.030＃＃LMS阳性组 80 2.519±0.031正常组 －＃＃

2.4 血清TNF－α含量的检测

模型组血清TNF－α含量远低于正常组（P＜0.01），与模型组比较，中剂量PPS80可提高免疫抑制小鼠血清TNF－α含量（P＜0.05），高剂量PPS80可显著增加免疫抑制小鼠血清TNF－α含量（P＜0.01），且影响作用强于阳性对照LMS（表3）。

表3 PPS80对免疫抑制小鼠血清TNF－α含量的影响 Table 3 Effects of PPS80on concentrations of TNF－αin serum of modle mice induced by CTX(± s， n＝9）

表3 PPS80对免疫抑制小鼠血清TNF－α含量的影响 Table 3 Effects of PPS80on concentrations of TNF－αin serum of modle mice induced by CTX(± s， n＝9）

＊.与正常组比较P＜0.01；＃.与模型组比较P＜0.05；＃＃.与模型组比较P＜0.01。

组别 剂量／（mg·kg－1·d－1） TNF－α含量／（μg·L－1）1.549±0.016模型组 － 1.339±0.030＊PPS80（低） 100 1.504±0.041 PPS80（中） 200 1.535±0.028＃PPS80（高） 400 1.625±0.022＃＃正常组 －LMS阳性组 80 1.539±0.011＃＃

3 讨论

免疫系统是生物体必备的防御机构，由免疫器官、免疫细胞、免疫分子组成。胸腺和脾脏是动物体内的主要免疫器官，胸腺、脾脏指数的高低能够较为客观地反应机体的非特异性免疫能力。本试验连续3天腹腔注射CTX后，造模组小鼠的胸腺指数和脾脏指数显著低于正常组，说明免疫抑制小鼠模型构建成功。在给予不同剂量PPS80治疗后，与模型组相比，低、中、高剂量的PPS80均可增加免疫抑制小鼠的胸腺指数和脾脏指数，且呈一定的剂量相关性。由此可见，PPS80能通过非特异性免疫调节作用增强CTX所致的免疫抑制小鼠的免疫功能。

IL－2是一种调节免疫应答的重要介质，主要由CD4＋和CD8＋T细胞分泌产生。Han S B等［4］用胸腺依赖性绵羊红细胞（sRBCs）免疫BDF1雌性小鼠后，腹腔给予桔梗多糖发现能显著提高多克隆抗体IgM的产生和B细胞的增殖，而不影响Th1细胞的IL－2表达，而本试验结果显示给予免疫抑制KM小鼠低、中、高剂量的PPS80均能显著提高血清中IL－2含量，这可能是由于整体动物水平与细胞水平评价差异所致，具体机制还有待进一步的研究。

在抗肿瘤免疫反应中，TNF－α是一类重要的细胞因子，主要由单核－巨噬细胞分泌。Yoon Y D等［6］证实桔梗多糖可诱导鼠巨噬细胞株RAW264.7释放TNF－α，而Park D I等［10］报道每日口服或腹腔给予桔梗多糖组分，连续30d后可抑制ICR系雌性小鼠艾氏腹水癌生长。本试验结果显示中、高剂量的PPS80均能显著提高血清中TNF－α含量，说明PPS80能促进免疫抑制KM小鼠的TNF－α释放，有可能作为肿瘤治疗的辅助药物。

总之，本试验结果显示PPS80能通过增加免疫抑制小鼠胸腺、脾脏指数，提高血清中IL－2和TNF－α含量从而增强免疫功能，这为桔梗多糖的进一步开发利用提供了科学依据。

1 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［S］.2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：259～260.

2 武博，刘萍.桔梗的现代研究进展 ［J］.中国药物应用与监测，2008，5（2）：48～50.

3 张莲姬，南昌希，张丽霞，等.桔梗多糖的提取及其抗氧化作用研究 ［J］.食品与机械，2008，24（3）：60～63.

4 Han S B，Park S H，Lee K H，et al.Polysaccharide isolated from the radix of Platycodon grandiflorum selectively activates B cells and macrophages but not T cells［J］.Int.Immunopharmacol，2001，1（11）：1 969～1 978.

5 Yoon Y D，Han S B，Kang J S，et al.Toll－like receptor 4－dependent activation of macrophages by polysaccharide isolated from the radix of Platycodon grandiflorum ［J］.Int.Immunopharmacol，2003，3（13～14）：1 873～1 882.

6 Yoon Y D，Kang J S，Han S B，et al.Activation of mitogen–activated protein kinases and AP－1by polysaccharide isolated from the radix of Platycodon grandiflorum in RAW 264.7cells［J］.Int.Immunopharmacol，2004，4（12）：1 477～1 487.

7 贾林，沃兴德，陆金健，等.桔梗多糖的提取与纯化［J］.生物学杂志，2011，28（2）：21～24.

8 贾林，陆金健，卢德赵，等.桔梗多糖的分离纯化与含量测定［J］.中国农学通报，2011，27（17）：83～86.

9 赵弋清，罗霞，陈东辉，等.不同剂量环磷酰胺诱导正常小鼠免疫抑制的对比研究 ［J］.免疫学杂志，2005，21（3）：122～124.

10 Park D I，Lee J H，Moon S K，et al.Induction of apoptosis and inhibition of telomerase activity by aqueous extract from Platycodon grandiflorum in human lung carcinoma cells［J］.Pharmacol Res.，2005，51（5）：437～443.

Immunoregulatory effect of polysaccharides fromPlatycodon grandiflorumA.DC on immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide

JIA Lin LU Jin－jian ZHOU Wen－ya SHI Jia－jieWO Xing－de

（College of Life－Science，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou，Zhejiang310053，China）

To study the effect of polysaccharides fromPlatycodon grandiflorumA.DC（PPS80）on immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide（CTX）.60male kunming mice were randomly divided into six groups：normal control，model group，PPS80lowdose treatment group（100mg／（kg·d）），PPS80middle－dose treatment group（200mg／（kg·d）），PPS80high－dose treatment group（400mg／（kg·d））and positive control group treated with levamisole hydrochloride（LMS）.Immunosuppressive model was established by intraperitoneal injection of CTX at the dose of 80mg／kg，once a day for 3d.After administrated with drugs for one week，thymus index and spleen index were determined by weight.Concentrations of IL－2 and TNF－αin serum were determined by sandwich ELISA assay kits.Results PPS80significantly increased thymus and spleen index and the concentrations of IL－2and TNF－αof the serum in a dose－dependent manner.PPS80has obvious immune－improving effects on immunosuppressive mice induced by CTX.

Platycodon grandiflorumA.DC；polysaccharides；immune enhancement；IL－2；TNF－α

10.3969／j.issn.1003－5788.2012.03.031

贾林（1984－），男，浙江中医药大学在读硕士研究生。E－mail：jialin03594365790＠163.com

沃兴德

2012－01－10