重金属铅酶联免疫检测方法的研究

杨依锦 王俊平 王 津 方淑兵 王 硕

（1.食品营养与安全教育部重点实验室，天津 300457；2.天津科技大学，天津 300457）

重金属铅酶联免疫检测方法的研究

杨依锦1，2王俊平1，2王 津1，2方淑兵1，2王 硕1，2

（1.食品营养与安全教育部重点实验室，天津 300457；2.天津科技大学，天津 300457）

制备铅离子多克隆抗体，并建立间接竞争ELISA检测方法。利用双功能螯合剂ITCBE将Pb2＋与载体蛋白KLH和BSA偶联在一起，制备免疫抗原与检测抗原；通过免疫新西兰大耳白免成功制备铅多克隆抗体，建立间接竞争ELISA检测方法，并与ICP－MS检测结果进行比较。标准曲线IC50为3.48ng／mL，IC15为0.32ng／mL，与ICP－MS法检测结果的总符合率超过97%。

铅；多克隆抗体；间接竞争ELISA

重金属是一种常见的污染源，其中铅的污染又尤为严重，对环境与人类造成了严重的危害。铅的毒性很强，是重金属污染中的“五毒”之一。它对人体的毒性作用包括神经毒性、肾脏毒性、造血系统毒性、心血管系统毒性、生殖系统毒性、关节毒性、内分泌系统毒性以及胃肠道和肝脏的毒性等，还会对儿童的生长发育产生影响［1－3］。

目前检测铅离子的主要方法有原子荧光光度法（AFS）、电感耦合等离子体质谱（ICP－MS）分析技术、电感耦合等离子原子发射光谱（ICP－AES）、高效液相色谱法（HPLC）等［4－8］，这些检测方法所需的仪器较昂贵，操作复杂，需要专业的工作人员。重金属免疫学检测方法是通过制备重金属的特异性抗体，利用抗原－抗体反应进行的快速、准确的检测方法，与传统检测技术相比有着快速，简单，价格低廉，适合现场监测等优点。本试验拟建立重金属铅间接竞争酶联免疫检测方法，同时将其用于实际样品添加回收的试验。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂

铅溶液、镉溶液、汞溶液、铁溶液、铬溶液、镍溶液、铜溶液、镁溶液、银溶液、锰溶液：中国国家标准物质研究中心；

1－（4－异硫氰酸苄基）－乙二胺四乙酸（ITCBE）：上海同仁化学研究所；

钥孔血蓝蛋白（KLH）、牛血清蛋白（BSA）、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、二甲基亚砜（DMSO）、N－（2－羟乙基）哌嗪－N′－2－乙烷磺酸（HEPES）：美国Sigma公司；

浓硝酸、高氯酸：优级纯，天津市化学试剂一厂；

自来水、海河水：采自天津本地；

白芷：购自天津某药房；

胡萝卜、皮皮虾：购自天津某超市。

1.1.2 仪器

酶标仪：Thermo 1500，美国Thermo公司；

蛋白纯化仪：BioLogic LP，美国BIO－RAD公司；

电感耦合等离子体质谱仪（ICP－MS）：7500cx（G3272B），美国 Agilent公司；

高压消解罐：LTG－PTFE，上海隆拓仪器设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫原的制备 抗原采用双功能螯合剂1－（4－异硫氰酸苄基）－乙二胺四乙酸（ITCBE）将重金属铅和钥孔血蓝蛋白（KLH）相连。取1.5mg ITCBE溶于1mL二甲基亚砜（DMSO）中，取标准硝酸铅溶液（1 000mg／L Pb2＋）0.7mL。将ITCBE缓慢滴加入Pb（NO3）2溶液中，用三乙胺将pH调到中性，常温反应过夜。取10mg KLH溶于pH 9.0的N－（2－羟乙基）哌嗪－N′－2－乙烷磺酸（HEPES）缓冲溶液中，将螯合好的Pb－ITCBE结合物缓慢滴加入蛋白溶液中，反应过程中，保持pH在8.0～9.0（用三乙胺调pH，使其值的稳定）。室温反应过夜。反应完全后在10mmol／L的pH为7.4的HEPES缓冲溶液中进行透析，除去未反应的小分子。放入－20℃保存备用。

1.2.2 包被抗原的制备 包被原采用双功能螯合剂ITCBE将重金属铅和牛血清蛋白（BSA）相连。取1.5mg ITCBE溶于500μL DMSO 中，取 标 准 硝 酸 铅 溶 液 （1 000mg／L Pb2＋）0.7mL。将ITCBE缓慢滴加入Pb（NO3）2溶液中，用三乙胺将pH调到中性，常温反应过夜。取10mg BSA溶于pH 9.0的 HEPES缓冲溶液中（2mL），将螯合好的Pb－ITCBE结合物缓慢滴加入蛋白溶液中，反应过程中，保持pH在8.0～9.0。室温反应过夜。反应完全后在10mol／L的pH为7.4的HEPES缓冲溶液中进行透析，除去未反应的小分子。放入－20℃保存备用。

1.2.3 抗体的制备 将制备好的免疫原同时免疫两只新西兰大耳白兔，初次免疫时，需将免疫抗原与完全弗氏佐剂按1∶1的体积比制备成“油包水”的乳液状，每只兔子的免疫剂量为1.0mg（用0.9%的生理盐水将免疫抗原稀释为1mg／mL的浓度）。第一次免疫时采取的是背部皮下多点注射和腿部肌肉注射。分别于初次免疫后2，4，8周加强免疫3次，每只兔子免疫剂量减半。在第3、4次免疫后的7～10d，进行耳静脉采血测定抗血清效价和亲和性，当抗血清效价与亲和性不再增加时采用股动脉采血法取全血［9］。本试验采用免疫亲和层析法进行抗体纯化，用Sepharose 4B－Protein A作亲和层析介质纯化抗血清，所得抗体用PBS透析后4℃保存备用。

1.2.4 重金属铅间接竞争ELISA检测方法的建立

（1）包被抗原的包被：用包被液将包被原稀释至1μg／mL，以100μg／孔的量包被在96孔酶标板上，4℃过夜孵育（12～16h），第2天将孔中液体弃去，然后用PBST溶液洗板3次。

（2）封闭：封闭液使用0.5%的脱脂乳粉溶液（200μg／孔），37℃恒温烘箱孵育1h。弃去封闭液后用PBST溶液洗板3次。

（3）加样：每孔先加入50μL螯合后的重金属标准溶液或样品提取液，然后加入50μL抗体稀释液（用PBS缓冲液稀释）。室温下在摇床震荡竞争反应1h，然后用PBST溶液洗板3次。

（4）加酶标二抗：加入用PBS稀释至10 000倍的酶标二抗（100μg／孔），室温孵育30min后，弃去二抗，然后用PBST溶液洗板3次。

（5）显色：每孔中加入100μL的底物液（底物A与TMB的混合溶液），室温下反应20min。

（6）终止：每孔中加入50μL的终止液（1.25M的浓硫酸），终止反应。

（7）读取吸光度值：在双波长方式（450～650nm）下用酶标仪读取吸光度值（OD值）。

（8）抑制率的计算：按式（1）进行。

式中：

R—— 抑制率，%；

OD对照—— 不加标准品的吸光值，即只加抗体的吸光值；

OD空白——不加标准品和抗体的吸光值，即只加PBS的吸光值；

OD——加了抗体和不同浓度标准品混合物的吸光值。

以重金属铅的浓度取对数后为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制出重金属铅的标准曲线。

1.2.5 抗体特异性的测定 本试验选择了ITCBE螯合后的金属汞（Hg）、镉（Cd）、铬（Cr）、银（Ag）、锰（Mn）、镍（Ni）、铜（Cu）、镁（Mg）、铁（Fe）及单独的螯合剂ITCBE进行交叉反应的测定，计算出各个竞争物的IC50值，得出它们与重金属铅（Pb）抗体的交叉反应率，以此判断抗体的特异性。

交叉反应率的计算：按式（2）进行。

式中：

CR—— 交叉反应率，%；

IC50对照——其他重金属螯合后所测得的IC50值；

IC50测定——重金属铅螯合后所测得的IC50值。

1.2.6 样品处理及基质影响的消除

（1）自来水样和海河水样：自来水经PBS缓冲液稀释5倍后，可消除基质影响；海河水需过0.22μm的水膜后，再用PBS缓冲液稀释8倍，可消除基质影响。

（2）其他样品（中药白芷、胡萝卜、皮皮虾）：将样品烘干后，粉碎成粉末，称取1g，使用强酸（浓硝酸10mL，高氯酸5mL）浸泡12h，第2天在高温（160～180℃）下硝化至溶液澄清，选用Tris－HCl将pH调至中性，然后过0.22μm的水膜，用双蒸水定容稀释60倍，可消除基质影响。

1.2.7 样品添加回收 每100mL自来水样品中分别添加浓度为1mg／mL的重金属Pb标准溶液0.2，2，6.5μL，最终添加的量分别为0.2，2，6.5μg，添加完后，与螯合剂ITCBE按摩尔比1∶1的比例进行螯合，经PBS缓冲液稀释5倍后，然后进行ic－ELISA测定；每100mL海河水样品中分别添加浓度为1mg／mL重金属Pb标准溶液0.32，3.2，10.4μL，最终添加的量分别为0.32，3.2，10.4μg，添加完后，需过0.22μm的水膜，与螯合剂ITCBE按摩尔比1∶1的比例进行螯合后，再用PBS缓冲液稀释8倍，然后进行ic－ELISA测定；其他基质样品处理为粉末后向其中每1g样品中分别添加浓度为1mg／mL的重金属 Pb标准溶液0.024，0.24，0.78μL，最终添加的量分别为0.024，0.240，0.78μg，之后按1.2.6所述方法进行硝化后，与螯合剂ITCBE按摩尔比1∶1的比例进行螯合，稀释后进行ic－ELISA测试，上述每个添加浓度都做3个平行试验。

回收率按式（3）计算：

式中：

Re—— 回收率，%；

C测定—— 实际测出的浓度；

C空白——未添加标品所测出的浓度；

C添加—— 实际添加的浓度。

1.2.8 仪器验证 本试验采用电感耦合等离子体质谱（ICP－MS）对建立的方法进行验证。按照步骤1.2.7的方法对基质进行添加后，同时用建立的ic－ELISA方法和ICPMS方法进行检测，并进行相关性分析。

2 结果与讨论

2.1 建立的ic－ELISA方法的标准曲线的绘制

在建立的间接竞争ELISA方法下，将螯合后的Pb标品从200ng／mL开始5倍梯度稀释，稀释6个浓度，得到不同浓度Pb标品的OD值，根据式（1）计算抑制率，从而绘制标准曲线。

图1 重金属铅ic－ELISA检测的标准曲线Figure 1 Standard curve of lead on ic－ELISA

由图1可知，灵敏度IC50为（3.48±0.09）ng／mL，最低检出限IC15为（0.32±0.02）ng／mL。

2.2 抗体特异性

本试验中交叉反应结果见表1。

表1 重金属铅的交叉反应Table 1 Cross－reactivity of lead

由表1可知，该抗体与其他金属和螯合剂ITCBE的亲和性较低，对重金属铅有较高的特异性。

2.3 样品处理与基质消除

根据1.2.6所述，处理样品后，所得到的基质曲线与标准曲线见图2。

一般认为相同浓度下标准曲线的抑制率与基质曲线的抑制率相差小于20%就可认定为基质影响基本消除。由图2可知，经过处理后的基质曲线与标准曲线基本重合，说明基质影响已消除。

2.4 回收率

由表2可知，对于自来水、海河水、中药白芷、胡萝卜、皮皮虾基质的回收率都在78.5%～121%，表明建立的间接ELISA检测法符合准确度的要求。

2.5 仪器验证

本试验建立的间接竞争ELISA方法与ICP－MS检测法的相关性试验结果见图3。由图3可知，两种方法检测结果一致性较高，线性相关系数R2＝0.976。结果充分表明了本试验建立的重金属铅间接ELISA检测方法结果的准确性，并且试验结果稳定可靠。

图2 基质影响的消除Figure 2 Eliminate of the matrix influence（ n＝3）

表2 重金属铅ic－ELISA检测法添加回收率表Table 2 Recovery studies of lead at three levels by ic－ELISA

图3 ic－ELISA和ICP－MS测定结果相关性曲线Figure 3 Correlations between ic－ELISA and ICP－MS results

3 结论

本试验采用双功能螯合剂ITCBE使得重金属铅与蛋白相连制备成免疫原后，成功获得高特异性的重金属铅多克隆抗体。建立的重金属铅间接竞争酶联免疫检测方法的灵敏度为IC50＝（3.48±0.09）ng／mL，最低检出限为IC15＝（0.32±0.02）ng／mL，线性范围为0.32～53.49ng／mL（此处以抑制率15%～90%为线性范围），相关系数R2值为0.999。

以ICP－MS检测方法为标准，对建立的重金属铅间接竞争ELISA检测方法的准确性进行了验证，线性相关系数R2值为0.976，结果证明了建立的重金属铅间接竞争ELISA检测方法具有较高的准确性。

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Development of enzyme－linked immunosorbent assay for heavy metal lead

YANG Yi－jin1，2WANG Jun－ping1，2WANG Jin1，2FANG Shu－bing1，2WANG Shuo1，2

（1.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education of China，Tianjin300457，China；2.Tianjin University of Science and Technology，Tianjin300457，China）

To prepare polyclonal antibody against heavy metal lead ion and develop an indirect competitive ELISA method.Lead was coupled to vector proteins keyhole limpet hemocyanin（KLH）and bovine serum albumin（BSA）via a bifunctional chelating agent ITCBE respectively，Pb（Ⅱ）－ITCBE－KLH was used as immunogen and Pb（Ⅱ）－ITCBE－BSA was used as coating antigen.The anti－Pb antibody was obtained after immunized to New Zealand white rabbits and an indirect competitive ELISA method was developed，by which the determination result was compared with that by ICP－MS method.The standard curve was developed with IC50of 3.48ng／mL and IC15of 0.32ng／mL，the total coincidence rate of the developed ELISA method and ICP－MS method was more than 97%.

heavy metal lead；polyclonal antibody；ic－ELISA

10.3969／j.issn.1003－5788.2012.03.022

杨依锦（1987－），女，天津科技大学在读硕士研究生。E－mail：yyj870319＠163.com

王硕

2012－01－11