复合氨基酸螯合钙的合成工艺优化

马海霞 杨贤庆 胡振珠

张 桢1 陈胜军1 杨 燕1

（1.中国水产科学研究院南海水产研究所，广东 广州 510300；2.国家水产品加工技术研发中心，广东 广州 510300）

复合氨基酸螯合钙的合成工艺优化

马海霞1，2杨贤庆1，2胡振珠1

张 桢1陈胜军1杨 燕1

（1.中国水产科学研究院南海水产研究所，广东 广州 510300；2.国家水产品加工技术研发中心，广东 广州 510300）

以鱼类加工下脚料鱼头、鱼排为原料制备复合氨基酸螯合钙，采用Plackett－Burman设计、最陡爬坡试验和中心组合设计法对螯合工艺条件进行优化。结果表明，pH值和氨基态氮对螯合率有显著影响（P＜0.05），复合氨基酸液中氨基酸的种类及其含量对螯合效果影响较大，当氨基酸浓度大于2.1mg／mL时，螯合钙中相应的氨基酸相对含量也较高；在复合氨基酸液与钙液螯合时，甲硫氨酸和甘氨酸对钙的螯合能力均大于丙氨酸。优化后的螯合工艺参数：pH值7.90，温度50℃，时间60min，氨基态氮浓度为3.66g／L，复合氨基酸液∶钙液（V∶V）20∶1，该条件下螯合率为58.19%。

Plackett－Burman设计；复合氨基酸螯合钙；甲硫氨酸；甘氨酸；螯合

氨基酸螯合钙是一类金属螯合物，与磷酸钙、碳酸钙、葡萄糖酸钙、醋酸钙、乳酸钙等相比，易于被人体吸收、副作用小、生物利用率高，而且在补钙的同时又可补充人体必需的氨基酸，是一种较理想的补钙产品［1－3］。罗非鱼、斑点叉尾鮰等鱼类加工下脚料占到鱼体重量的50%以上，如中国冻罗非鱼片2009年产量超过22万t，仅产生的鱼头、鱼排下脚料就超过14万t，约占鱼体重量的36%～40%［4］；这些下脚料多作为饲料原料被廉价销售，附加值很低。鱼骨中除含有蛋白质、脂肪等营养元素以外，还含有大量的钙、铁、锌、镁、磷及胶原成分，是开发骨源补钙产品的良好资源。

国内关于氨基酸螯合钙合成工艺的文献报道很多，主要表现在两方面：① 由单一氨基酸与某一钙盐反应的制备工艺［5－7］；② 复合氨基酸螯合钙的制备工艺［1，8－12］，其复合氨基酸和钙源分别是鸡羽毛水解物和文蛤壳、米渣蛋白水解物和Ca（OH）2、豆粕水解物和动物骨骼或骨渣（生产骨胶的废弃物）、低值鱼蛋白酶解物和CaCl2等。而以鱼类加工废弃物鱼头、鱼排酶解物为复合氨基酸来源、鱼骨为钙源开发复合氨基酸螯合钙产品迄今较少见报道。本试验以罗非鱼加工下脚料鱼头、鱼排为原料，采用Plackett－Burman设计、最陡爬坡试验和中心组合设计优化出最适螯合工艺条件，并对比、分析酶解液和螯合钙产品中的氨基酸组成及其含量，以期为鱼类加工下脚料的高值化利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鱼头、鱼排：广州市恒发水产有限公司；

钙标准溶液：浓度为（999±2）mg／L，德国 Merck公司；

胰蛋白酶：酶比活力1×105U／g，广州齐云生物科技有限公司；

风味蛋白酶：酶比活力8×104U／g，广州华琪生物有限公司；

氨基酸标准品：美国sigma公司；

其它试剂：均为分析纯；

试验所有用水：均为超纯水。

1.2 仪器与设备

离心机：TD5A－WS，湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司；

pH 计：PB－10，德国Sartorius集团；

恒温水浴锅：DK－S 24型，上海森信实验仪器有限公司；

电热恒温鼓风干燥箱：DHG－9145型，上海恒科技术有限公司；

旋转蒸发仪：EYELA N－1000，托普仪器有限公司；

紫外／可见分光光度计：Spectronic GENESYS 5，美国Thermo公司；

智能电位滴定仪：809Titrando，瑞士万通中国有限公司；

原子吸收分光光度计：AA240FS，美国Varian公司；

微波消解器：MARS5，美国CEM公司；

氨基酸自动分析仪：日立835－50型，日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 复合氨基酸螯合钙制备工艺流程

1.3.2 复合氨基酸液制备 取一定质量鱼头、鱼排，剁碎，按以下条件酶解：固液比3∶1（m∶V），pH 6.5，酶浓度1.5%，复合酶比例（风味蛋白酶∶胰蛋白酶）1∶3，酶解温度50℃，酶解时间4h。酶解结束后，将酶解液温度升至90℃并保持20min灭酶，冷却，过滤，滤液贮藏于4℃备用。

1.3.3 Plackett－Burman设计 影响螯合率的可能因素有pH值、反应温度、氨基态氮浓度、时间、复合氨基酸液∶钙液（体积比）等［13，14］，对这5个因素进行考察，选用N＝6的Plackett－Burman设计，并设1个空白作为误差分析项。每个因素取高（＋1）低（－1）两个水平，以螯合率作为响应值，运用Minitab 15软件分析计算各因素的效应值，并对各因素效应进行t检验，选择显著因素进一步试验。各因素所代表的参数、水平见表1。

表1 Plackett－Burman设计的因子水平表Table 1 Factors and levels of Plackett－Burman design

1.3.4 最陡爬坡试验设计和中心组合试验设计 由Plackett－Burman法筛选出的显著因子是pH值（X1）和氨基态氮浓度 （X4），pH值的最小值和最大值分别取6.25、8.50，氨基态氮浓度的最小值和最大值分别取2.0、3.8，pH值、氨基态氮浓度的步长分别取0.25、0.2，进行最陡爬坡试验。

根据最陡爬坡试验结果，选择pH值、氨基态氮浓度分别为8.25、3.60作为响应面试验因素水平的中心点进行响应面试验设计。响应面中心组合设计的因素及水平见表2。

表2 响应面中心组合设计的因子水平表Table 2 Factors and levels of response surface central composite design

1.3.5 钙的测定 采用微波消解－火焰原子吸收分光光度法测定。

（1）样品前处理：称取样品约0.500g，置于聚四氟乙烯消解罐中，加入硝酸10mL，在微波消解仪中消解（功率800W，比例100%，升温时间15min，消解温度180℃，保持时间20min）。消解结束后，取出消解罐，冷却，将消解液转移至聚四氟乙烯溶样杯中，在电热板上于180℃赶酸直至消解液为无色透明，冷却，然后将其转入100mL容量瓶中用20g／L氧化镧定容至刻度，待测定。

（2）仪器操作参数：波长422.7nm，夹缝0.5nm，空气流量13.5L／min，乙炔流量2.00L／min，灯电流10.0mA。

1.3.6 游离氨基酸含量的测定 游离氨基酸样品制备：称取约0.100 0g样品，加入5%磺基水杨酸10mL浸提24h，离心（15 000r／min，4℃，15min），收集上清液；重复以上步骤两次，合并上清液，移入50mL容量瓶中，用水定容，待上机分析。仪器测定条件：离子交换柱，2.6mm×150mm；交换树 脂 型 号，NO.2619（52051）；柱 温，53 ℃；泵 流 速：0.225mL／min；泵压力：90kg／cm2；洗脱液：IPH－1，2，3，4；分析时间：72min；进样体积：50μL。

1.3.7 螯合率计算 螯合率按式（1）计算：

式中：

c—— 螯合率，%；

m1——鳌合态钙元素含量，g；

m2——反应体系中钙元素含量，g。

1.4 统计分析

采用Minitab 15软件对试验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 Plackett－Burman试验设计及结果

Plackett－Burman试验设计及结果见表3、4。由表4可知，对螯合率有显著影响（P＜0.05）的因子是pH值和氨基态氮浓度，二者对螯合率均有正效应，要提高螯合率可以适当提高pH值和氨基态氮浓度。其它因素影响不显著，可以维持在较低水平。

2.2 最陡爬坡试验设计及结果

响应面拟合方程只有在考察的邻近区域里才能较好地反映真实情形，所以，要先逼近最大螯合区域后才能建立有效的拟合方程。根据Plackett－Burman法筛选出的显著因子效应大小设定它们的步长，进行最陡爬坡试验设计，寻找最大螯合区。

表3 Plackett－Burman试验设计及结果Table 3 Experimental design of Plackett－Burman and corresponding rusults

由表4可知，pH值和氨基态氮浓度为显著影响因子，因此选择这两个因子进行最陡爬坡试验。由于pH值对螯合效果的影响较大，选pH值作为标准，按照pH递增，氨基态氮浓度相应递增设计试验，pH值、氨基态氮浓度的步长依次取0.25、0.2。最陡爬坡试验设计及结果见表5。由表5可知，最大螯合率出现在第9次试验附近，故以试验9的条件作为中心组合试验设计的中心点。

表4 Plackett－Burman试验参数估计表 Table 4 Parameter estimation of Plackett－Burman design

表5 最陡爬坡试验设计及结果Table 5 Experimental design of steepest ascent and corresponding results

2.3 响应面分析法优化工艺条件

以螯合效果最好的区域进行响应面中心组合试验设计，2因素5水平的响应面中心组合试验设计及结果见表6。

2.3.1 回归模型的建立及置信度分析 由Minitab 15软件拟合的方程：

回归模型系数的估计见表7，方差分析见表8。由表7、8可知，交互项的系数和均方差较小，说明响应面分析所选的2个因素之间交互效应较小。在α＝0.01水平上，该模型失拟不显著，回归高度显著。决定系数R2＝97.89%，表明97.89%的变化可由此模型解释，因此可以用上述模型代替真实试验点对复合氨基酸螯合钙的螯合率进行分析和预测。

表6 中心组合试验设计及结果Table 6 Central composite design and corresponding results

表7 中心组合试验设计参数估计表Table 7 Parameter estimation of central composite design

表8 中心组合试验设计方差分析表 Table 8 Analysis of variance for central composite design

2.3.2 显著因素水平的优化 运用Minitab 15软件对回归方程进行分析，结合图1、2三维响应面图和等高线图可求出的该方程的最大值及对应的因素水平X1＝ －1.414，X4＝0.271 4，即pH 值为7.896 5，氨基态氮浓度为3.654 3g／L。考虑到实际的操作，pH取7.90，氨基态氮浓度为3.66g／L。优化后的螯合工艺参数：pH 值7.90，温度50℃，时间60min，氨基态氮浓度为3.66g／L，复合氨基酸液∶钙液为20∶1（V∶V），此时的理论最大螯合率为62.04%。而实际螯合率为58.19%，说明实际产量与预测值比较接近，模型能很好的预测螯合情况。

图1 pH值和氨基态氮浓度对螯合率的响应图Figure 1 Surface plot for the effects of pH vs.amino nitrogen concentration on chelating rate

图2 pH值和氨基态氮浓度对螯合率的等高线图Figure 2 Contour plots for the effects of pH vs.amino nitrogen concentration on chelating rate

2.4 复合氨基酸液与螯合钙产品中的氨基酸组成对比分析

由表9可知，复合氨基酸液中含量最多的6种氨基酸依次是亮氨酸、赖氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸（含量均大于2.4mg／mL），它们之和占到氨基酸总量的61.45%；对应螯合钙中含量最多的氨基酸也依次是这6种，它们占到螯合钙氨基酸总量的62.43%。此外，在复合氨基酸液中含量小于2.0mg／mL的丙氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸分别占氨基酸总量的百分比为5.07%、4.62%、2.66%，但在螯合钙中三者占氨基酸总量的百分含量则分别为4.02%、5.15%、4.21%，这说明复合氨基酸液与钙液螯合时，甲硫氨酸和甘氨酸对钙的螯合能力均大于丙氨酸。

表9 复合氨基酸液与螯合钙中的氨基酸种类和含量Table 9 Variety and content of amino acid in compound amino acid solution and chelated compound amino acid calcium

3 结论

（1）优化后的螯合工艺参数：pH值7.90，温度50℃，时间60min，氨基态氮浓度为3.66g／L，复合氨基酸液∶钙液为20∶1（V∶V）。在此条件下理论螯合率为62.04%，而实际螯合率为58.19%，说明实际产量与预测值比较接近，模型能很好的预测螯合情况。

（2）复合氨基酸液中的氨基酸种类及其含量对螯合效果影响较大，当氨基酸含量大于2.1mg／mL时，螯合钙中对应的氨基酸相对含量也较高；复合氨基酸液中含量小于2.0mg／mL的丙氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸，在复合氨基酸液与钙液螯合时，前两者对钙的螯合能力均大于丙氨酸。

（3）所制得的复合氨基酸螯合钙产品为粉末状，色泽淡黄，具特有的鲜味，暴露于空气中易吸潮变粘，钙含量为26.14mg／g，溶解度为78.42g／100g，水溶液 pH 值 为6.23±0.05。

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Optimization of synthetization process for chelated compound amino acid calcium

MA Hai－xia1，2YANG Xian－qing1，2HU Zhen－zhu1

ZHANG Zhen1CHEN Sheng－jun1YANG Yan1

（1.South China Sea Fisheries Research Institute，CAFS，Guangzhou，Guangdong510300，China；2.National R＆D Center for Aquatic Product Processing，Guangzhou，Guangdong510300，China）

The chelating condition of chelated compound amino acid calcium from fish heads and fish ribs was optimized using Plackett－Burman design，steepest ascent design and central composite design.The experiments results indicated that pH value and the concentration of amino nitrogen significantly affected the chelating rate（P＜0.05）.The variety and content of amino acid in compound amino acid solution also had influence to the chelating rate，the amino acid content in the chelated calcium was higher when the amino acid concentration was more than 2.1mg／mL，and calcium was easier to be chelated by methionine and glycine than alanine.The optimal chela－ting condition for maximum chelating rate was：pH value 7.9，temperature 50℃，chelating time 60min，concentration of amino nitrogen 3.66g／L，volume ratio（volume of compound amino acid solution：volume of calcium solution）20∶1，and the highest chelating rate was 58.19%.

Plackett－Burman design；chelated compound amino acid calcium；methionine；glycine；chelate

10.3969／j.issn.1003－5788.2012.01.057

国家现代农业产业技术体系（编号：CARS－49）；国家农业科技成果转化资金项目（编号：2010GB23260577；2010GB2E000335）；广东省科技计划项目（编号：2009A020700004）；广东省水产蛋白改性技术研究团队专项经费（编号：2011A020102005）

马海霞（1977－），女，中国水产科学研究院助理研究员，硕士。E－mail：haixiam＠gmail.com

杨贤庆

2011－11－10