沙棘叶中总多酚和总黄酮的提取工艺

李 峰刘 浩钟 媛刘玉梅

（1.新疆大学化学化工学院，新疆 乌鲁木齐 830046；2.新疆大学现代教育技术中心，新疆 乌鲁木齐 830046）

沙棘叶中总多酚和总黄酮的提取工艺

李 峰1刘 浩2钟 媛1刘玉梅1

（1.新疆大学化学化工学院，新疆 乌鲁木齐 830046；2.新疆大学现代教育技术中心，新疆 乌鲁木齐 830046）

利用正交试验L9（34）和单因素相结合的方法，研究采用超声波辅助提取技术提取沙棘叶中总多酚和总黄酮的工艺。结果表明，沙棘叶中的总多酚和总黄酮在20kHz的超声波作用频率下极易溶出，优化后的工艺条件为以40%的乙醇为提取剂，在20kHz的超声波作用频率下室温萃取15min。在该条件下，沙棘叶总黄酮的提取率为5.034%，沙棘叶总多酚的提取率为10.712%。该方法具有简便、高效，省时等优点，可为工业化生产提供指导。

沙棘叶；总多酚；总黄酮；超声波；提取

沙 棘 （Hippophae rhamnoides L.） 为胡颓子科（Elaeagnaceae）酸刺属的灌木或小乔木。沙棘在中国种植广泛，它的根、茎、叶、花、果中含有200多种营养物质［1］，其中所含的总黄酮类是沙棘的主要药用活性成份［2］。目前对沙棘果实多酚及黄酮类化合物的研究报道很多，研究的也较深入，获得了很多非常有价值的成果，但关于沙棘叶总多酚和总黄酮类化合物的综合提取工艺的研究报道较少。本试验采用超声波技术辅助溶剂提取的方法考察了沙棘叶总多酚与总黄酮的综合提取工艺，旨在为沙棘叶中总多酚和总黄酮的进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沙棘叶：采自新疆青河县境内；

乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、碳酸钠等：均为市售分析纯；

福林－酚：美国Sigma－Adrich公司；

芦丁、没食子酸：中国药品生物制品检定所。

1.2 仪器与设备

电子天平：BS210S，德国赛多利斯公司；

紫外/可见分光光度计：UV－5300PC，上海元析仪器有限公司；

数显恒温水浴锅：HH－S4，金坛市医疗仪器厂；

超声波清洗仪：SY－3600，张家港市三友超声设备厂；

三频数控超声波清洗器：KQ－100UED型，昆山市超声仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 沙棘叶总多酚及总黄酮提取工艺流程

沙棘叶粉末20目→乙醇提取→过滤→滤渣用乙醇溶剂洗涤2次→合并滤液→定容→测定总多酚和总黄酮含量

1.3.2 试验设计方案

（1）超声波频率对提取率的影响：称取2g沙棘叶，加入40mL 40%乙醇提取，提取温度40℃，总提取时间为45min，期间超声波辅助作用15min，设置超声波频率分别为20，45，80，100kHz。用分光光度计分别测总多酚及总黄酮的含量。

（2）水浴时间对提取率的影响：称取2g沙棘叶，加入40mL 40%乙醇提取，提取温度40℃，超声波频率20kHz，辅助作用15min，水浴时间分别为60，45，30，15min。用分光光度计分别测总多酚及总黄酮的含量。

（3）温度对提取率的影响：称取2g沙棘叶，加入40mL 40%乙醇提取，超声波频率20kHz，提取时间15min（期间超声辅助10min），水浴温度分别为70，60，50，40，30℃，室温。用分光光度计分别测总多酚及总黄酮的含量。

（4）超声波作用时间的影响：称取2g沙棘叶，加入40mL 40%乙醇提取，超声波频率为20kHz，总提取时间15min，在室温下，分别设置超声波作用时间为15，10，5min。用分光光度计分别测总多酚及总黄酮的含量。

（5）正交试验设计方案：根据单因素试验结果，以水浴温度、水浴时间、超声时间及乙醇浓度4个因素为考察因子，以综合指标作为评价依据，进一步优化提取工艺参数。

1.3.3 黄酮定性试验

（1）络合反应：取1mL提取液于试管中，加3滴1%硝酸铝溶液，在紫外灯下观察颜色；或取1mL提取液于试管中，加2滴1%氯化铁溶液，观察颜色［3］。

（2）显色反应：取2～3滴提取液于滤纸上风干，以挥发氨熏滤纸，观察颜色；或向1mL提取液中加5mL 1mol/L氢氧化钠溶液，观察颜色［4］。

（3）还原反应：取1mL萃取液于试管中，加入少量的镁粉，摇匀，加4～5滴浓盐酸，在水浴上加热3min，观察颜色变化。由于花色素本身在酸性条件下呈红色，因此如果样品中含有花色素，对此反应具有干扰，空白为不加镁粉［5］。

1.3.4 总黄酮含量的测定

（1）总黄酮标准曲线的制作：参照文献［6］。

（2）总黄酮含量的测定：准确吸取1.0mL提取液，按照1.3.4（1）的方法，将加入的标准样品用相应的提取液来替代，测定其吸光值，代入上述芦丁的标准曲线中，求出样品的总黄酮含量。总黄酮含量按式（1）计算：

式中：

M—— 总黄酮含量，g/100g；

C—— 提取液黄酮浓度，mg/mL；

V—— 提取液体积，mL；

n—— 稀释倍数；

m—— 用于提取的沙棘叶质量，g；

d——常数，使得m×d＝100g。

1.3.5 总多酚含量的测定 采用福林－酚比色法（Folin－Ciocalteu）。

（1）总多酚标准曲线的制作：参照文献［6］。

（2）总多酚含量的测定：将加入的标准样品用相应的提取物来替代，所测得的吸光值，代入上述没食子酸的标准曲线中，求出样品的总多酚含量。总多酚含量按式（2）计算：

式中：

M—— 总多酚含量，g/100g；

C—— 提取液多酚浓度，μg/mL；

n——稀释倍数；

V——提取液体积，mL；

m——用于提取的沙棘叶质量，g；

d—— 常数，使得m×d＝100g。

1.3.6 综合指数的计算 本试验同时考察了沙棘叶中总多酚和总黄酮收率两个指标，综合指标是以这两个指标的加权和来计算的，以综合指标加权值高的水平组合为好。因总黄酮的收率为更重要的因素，综合指数按式（3）计算：

1.4 统计分析

试验数据的统计分析结果均是采用Microsoft Excel或OriginPro 7.5专业软件来处理的。

2 结果与讨论

2.1 沙棘叶中总多酚和总黄酮的工作曲线

用比色法测得芦丁与没食子酸的标准曲线，结果表明，芦丁的回归方程为C＝0.082 9×A，R2＝0.999 9。没食子酸的回归方程为C＝109.95×A－7.053 9，相关系数R2＝0.999 1。均符合试验操作条件和工作要求。

2.2 提取沙棘叶总多酚及总黄酮的正交试验

单因素试验结果表明，沙棘叶中的总多酚和总黄酮在20kHz的超声波作用频率下极易溶出。因此，固定超声波频率为20kHz，以水浴温度、水浴时间、超声时间及乙醇浓度4个因素为考察因子，设计正交试验。正交试验的因素水平取值见表1，正交试验结果见表2。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonalexperiments

由表2可知，超声时间影响最大，超声时间为15min时提取效果最优，3种乙醇浓度的提取结果相差不大，考虑到经济效益，最终选择40%乙醇为溶剂。结合单因素和正交试验可知，反应温度越高以及水浴时间越长，综合指数越低，可能是沙棘叶中总多酚和总黄酮对温度比较敏感，容易损失；当提取时间过长时，易造成沙棘叶中活性成分的氧化损失。因此，确定反应温度为室温，提取时间为15min。即：优化后的工艺条件为以40%的乙醇为提取剂，在20kHz的超声波作用频率下室温萃取15min。该条件下沙棘叶总黄酮的提取率为5.034%，总多酚的提取率为10.712%。

表2 正交试验结果Table 2 Results of the orthogonal experiments

2.3 沙棘叶提取物的定性分析结果

由表3可知，沙棘果渣中的黄酮类化合物主要是以黄酮醇的形式存在［7］，而由表3可知，沙棘叶提取物中也含有这种物质，另外可能还含有少量的黄酮类及二氢黄酮类化合物。

2.4 沙棘中总黄酮的提取比较

通过与已有文献报道中总黄酮的提取率相比较（见表4），可知超声波法具有省时，高效，能耗低，方法简便，活性成分保留完全等优点。

表3 颜色反应结果Table 3 Results of color reaction

表4 总黄酮提取方法的比较Table 4 The comparison of the total flavonoid extraction methods

3 结论

沙棘叶中总多酚与总黄酮类化合物的含量丰富，利用超声波辅助萃取可以明显地提高萃取效率，由于沙棘叶多酚和黄酮类对温度较为敏感，所以优化的提取条件为以40%的乙醇为提取剂，在20kHz的超声作用频率下室温萃取15min。该条件下，沙棘叶总黄酮的提取率为5.034%，沙棘叶总多酚的提取率为10.712%。

1 李树志，鲁长征，山永凯，等.发酵条件对沙棘冰酒品质的影响［J］.食品与机械，2009，25（4）：128～130.

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3 李颖畅，孙建华，孟宪军.蓝莓叶总黄酮提取物的定性分析和抗油脂氧化［J］.食品科学，2010，31（13）：96～99.

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Technology of total polyphenols and total flavones extracted from sea buckthorn leaves

LI Feng1LIU Hao2ZHONG Yuan1LIU Yu－mei1

（1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Xinjiang University，Urmuqi，Xinjiang830046，China；2.Modern Education Technology Centerm，Xinjiang University，Urmuqi，Xinjiang830046，China）

The Ultrasonic－aided extraction technology of total polyphenols and total flavones extraction from Sea Buckthorn Leaves were investigated by orthogonal experiments L9（34）combined with single factor experiments.The results indicated that total polyphenols and total flavones were easily dissolution in 20kHz for ultrasonic frequency.The optimum conditions were as follows：ultrasonic frequency 20kHz effect，extraction time 15min，the ethanol concentration 40%and extraction temperature was room temperature.The flavone yields obtained under such conditions was 5.034%，the polyphenol yield was 10.712%.This technological method was simple and convenient，efficient，time－saving，which could provide practical significance for industrialization production.

sea buckthorn leaves；total polyphenol；total flavones；ultrasonic extraction；extract

10.3969 /j.issn.1003－5788.2012.04.035

新疆维吾尔自治区高技术研究发展项目（编号：200915125）

李峰（1987－），女，新疆大学在读硕士研究生。E－mail：lifeng310＠yeah.net

刘玉梅

2012－01－27