硒化壳寡糖的合成及抗氧化作用研究

金黎明，郝 苗，赵小菁，李春斌，齐小辉，范圣第

(1.大连民族学院生命科学学院，辽宁大连116605;

2.大连市产品质量监督检验所，辽宁大连 116021)

硒化壳寡糖的合成及抗氧化作用研究

金黎明1，郝 苗2，赵小菁1，李春斌1，齐小辉1，范圣第1

(1.大连民族学院生命科学学院，辽宁大连116605;

2.大连市产品质量监督检验所，辽宁大连 116021)

以亚硒酸钠和壳寡糖为原料，合成了硒化壳寡糖，产率为37.26%，硒含量为9.02 mg·g－1。利用紫外－可见光谱、红外光谱两种表征手段，证实了硒化壳寡糖的合成。采用邻二氮菲－Fe2+氧化法、邻苯三酚自氧化法以及总抗氧化能力试剂盒测定硒化壳寡糖的抗氧化能力。结果表明，在实验设置的浓度范围内，硒化壳寡糖的抗氧化能力随着浓度的增加而增加，且硒化壳寡糖的抗氧化能力高于壳寡糖。1 mg·mL－1的硒化壳寡糖对羟自由基的清除率为40.27%，对超氧阴离子的清除率为38.68%，总抗氧化能力为每mL 0.617单位。实验为研究低毒性、有效的有机补硒产品奠定了基础。

壳寡糖;硒化壳寡糖;合成;表征;抗氧化性

壳聚糖(chitosan)是甲壳素(chitin)的N－脱 乙酰基的产物，目前已有研究证明，壳聚糖在化学水平、细胞水平和动物整体水平上具有一定的抗氧化作用［1－2］。壳寡糖(chitooligosaccharide)是壳聚糖的降解产物，相对于壳聚糖而言，壳寡糖具有相对分子量小，可溶性高，生物活性高等优点。近年来的研究证实，壳寡糖在提高人体免疫力，抗癌，降低血压、血脂、血糖，促进钙以及其他微量元素吸收等方面有显著的功效。

硒(selenium)是人体所必需的微量元素之一，人体(按体重70 kg)含硒量为43 mg，正常人体应维持硒量14～21 mg，人体日排硒量为0.15 mg，若不进行补硒，则人易患疾病。1997年国际上推荐每人每日需要硒量为0.06 mg。由于硒本身具有极高的抗氧化能力，在延缓衰老、抗癌、增强人体免疫力等方面具有明显的功效，甚至被人赞誉为“抗癌之王”［3］。但大多数无机硒化合物毒性较大，最低致死量相对较小(如亚硒酸钠对大鼠腹腔注射的最低致死量是 3.25～3.5mg·kg－1)，其应用受到极大的限制［4］。所以，寻找生物活性相对较高且毒性相对较低的有机硒替代品就成为给机体补硒的首要任务。目前已有研究表明，有机硒多糖作为补硒剂不仅稳定性好，溶出性高，而且释放出硒后配体多糖不会对机体产生毒副作用，是理想的补硒产品［5－9］，因此对硒化壳聚糖的研究也引起了广泛的关注［10－12］。但是，对硒化壳寡糖(chitooligosaccharide－selenium)的研究还相对较少。

本文以亚硒酸钠和壳寡糖为原料，合成了硒化壳寡糖，利用紫外－可见光谱、红外光谱两种表征手段对其进行表征，并采用邻二氮菲－Fe2+氧化法、邻苯三酚自氧化法以及总抗氧化能力试剂盒测定其抗氧化能力。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂

Lambda25型紫外－可见分光光度计(美国PE公司)，370DTGS型红外光谱仪(美国Thermo公司)，UV－2100型分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)。壳寡糖由中国海洋大学海洋生命学院提供，分子量为3 000 Da左右。其他试剂均为国产分析纯。总抗氧化能力试剂盒购于上海天呈科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 硒化壳寡糖的合成

硒化壳寡糖参考徐春兰等［10］介绍的方法进行制备。准确称取壳寡糖1.0 g，溶于49 mL的去离子水中，加入1 mL冰乙酸，搅拌溶解至澄清。取亚硒酸钠1.33 g，溶于10 mL的水中，缓慢加入到壳寡糖溶液中。搅拌混匀后放置2 h，使其充分反应。加入3倍体积的无水乙醇，室温条件下过夜醇析。抽滤，并用无水乙醇洗涤2次，冷冻干燥即得硒化壳寡糖样品。

1.2.2 硒化壳寡糖中硒含量的测定

用邻苯二胺比色法测定硒含量［13］。

1.2.3 紫外光谱法对硒化壳寡糖进行表征

将壳寡糖和硒化壳寡糖用去离子水配成0.04 mg·mL－1的溶液，去离子水为参比进行紫外光谱测定，波长扫描范围为200～400 nm。

1.2.4 红外光谱法对硒化壳寡糖进行表征

将少量的壳寡糖和硒化壳寡糖用KBr压片，进行红外光谱测定，测定范围为400～4000 cm－1。

1.2.5 清除羟自由基的测定

采用邻二氮菲－Fe2+氧化法测定硒化壳寡糖清除羟自由基的能力，并以维生素C为对照实验［14］。

1.2.6 清除超氧阴离子的测定

采用邻苯三酚自氧化法测定硒化壳寡糖清除超氧阴离子的能力，并以维生素C为对照实验［15］。

1.2.7 总抗氧化能力的测定

分别取0.100 g的壳寡糖和硒化壳寡糖，加水定容到100 mL，配制成1 mg·mL－1的样品溶液，按照总抗氧化能力试剂盒说明书进行操作。

2 结果与讨论

2.1 硒化壳寡糖的合成

得到的硒化壳寡糖为无定形的黄色粉末，无臭，产率为37.26%。经邻苯二胺比色法测定硒含量为 9.02 mg·g－1。

2.2 紫外图谱

紫外－可见吸收光谱图如图1。

图1 紫外－可见吸收光谱图(a.硒化壳寡糖;b.壳寡糖)

从图1中可以看出，硒化壳寡糖与壳寡糖的吸收曲线在200～250 nm吸收值下降较快，而在250 nm之后吸收值下降缓慢。在300 nm左右，硒化壳寡糖与壳寡糖相对出现一个明显的吸收峰。这种差异表明金属元素硒和壳寡糖之间发生了反应，使硒化壳寡糖的紫外吸收值发生了变化。

2.3 红外图谱

红外吸收光谱图如图2。

图2 红外吸收光谱图(a.硒化壳寡糖;b.壳寡糖)

从壳寡糖与硒化壳寡糖的红外光谱图的对比中可以看出，亚硒酸根主要连接在C2位的氨基和C6的羟基上。由以下光谱图形和光谱数据变化得到证明:硒化后壳寡糖的氨基(－NH2)的剪式振动吸收峰由 1 627.92 cm－1移动到 1 629.85 cm－1;壳寡糖分子中的羟基(－OH)的变角振动吸收峰由 1 033.85 cm－1移动到 1 035.77 cm－1;此外，在硒化壳寡糖的红外光谱中观测到位于806.25 cm－1的Se=O双键振动峰。据此推断，合成的硒化壳寡糖可能在C2位的氨基和C6的羟基上引入了亚硒酸根。

2.4 硒化壳寡糖对羟自由基的清除作用

壳寡糖、硒化壳寡糖和维生素C对OH·的清除率曲线如图3。

图3 壳寡糖、硒化壳寡糖和维生素C对OH·的清除率曲线

由图3可见，壳寡糖和硒化壳寡糖都具有一定的抗氧化能力，且抗氧化能力都随着质量浓度的升高而增强;相同质量浓度的硒化壳寡糖抗氧化能力要高于壳寡糖，且随质量浓度升高，这种趋势愈明显。以1 mg·mL－1的硒化壳寡糖和壳寡糖为例，它们对羟自由基的清除率分别为40.27%和29.94%，接近于浓度为 0.5 mg·mL－1的维生素C对羟自由基的清除率。

2.5 硒化壳寡糖对超氧阴离子的清除作用

壳寡糖、硒化壳寡糖和维生素C对超氧阴离子的清除率曲线如图4。

图4 壳寡糖、硒化壳寡糖和维生素C对超氧阴离子的清除率曲线

由图4可见，硒化壳寡糖相对于壳寡糖而言，对超氧阴离子具有更好的清除能力。以1.0 mg·mL－1的硒化壳寡糖和壳寡糖为例，其对超氧阴离子的的清除率分别为38.68%和32.18%，高于0.5 mg·mL－1的维生素C对超氧阴离子的清除率。

2.6 硒化壳寡糖的总抗氧化能力

通过计算可得，硒化壳寡糖的总抗氧化能力为每mL 0.617单位，高于壳寡糖的总抗氧化能力(每 mL 0.247 单位)。

3 结论

本实验以亚硒酸钠和壳寡糖为原料，合成了一种新型的有机硒产品——硒化壳寡糖。通过邻二氮菲－Fe2+氧化法、邻苯三酚自氧化法以及总抗氧化能力试剂盒测定其抗氧化能力，结果表明，在实验设置的范围内，硒化壳寡糖的抗氧化能力随着质量浓度的增加而增加，由于分子中引入了硒这种具有抗氧化能力的元素，其抗氧化能力要高于单一的壳寡糖，并且随质量浓度升高，这种趋势愈加明显。维生素C是已被公认的具有较强抗氧化性的物质，常被用作评价抗氧化能力的对照物。本实验合成的硒化壳寡糖虽然抗氧化性略低于维生素C，但综合考虑其抗氧化及补硒作用，仍不失为一种较为理想的产品。结果表明，合成的硒化壳寡糖是一种具有较好抗氧化能力的有机硒多糖，为进一步研究低毒性、高活性的有机补硒剂提供了思路与参考。

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Research of Synthesis and Antioxidant Activity of Chitooligosaccharide－selenium

JIN Li－ ming1，HAO Miao2，ZHAO Xiao － jing1，LI Chun －bin1，QI Xiao －hui1，FAN Sheng －di1
(1.College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian Liaoning 116605，China;
2.Dalian Institute of Product Quality Supervision and Inspection，Dalian Liaoning 116021，China)

Sodium selenite and chitooligosaccharide were used to synthesize chitooligosaccharide－ selenium in this experiment by chemical method.The yield was 37.26%and the content of selenium was 9.02 mg/g.Chitooligosaccharide－selenium was characterized by visible ultraviolet(UV －VIS)and infrared(IR)techniques.The results proved the successful synthesis of chitooligosaccharide－selenium.The antioxidant activities in vitro of chitooligosaccharide－selenium was investigated by phenanthroline－Fe2+，pyrogallol autoxidation and T －AOC kit.The results showed that in the setting concentration range，the antioxidant activities increased with the elevation of concentration.The antioxidant activities of chitooligosaccharide－selenium were better than that of chitooligosaccharide.The clearance rates of hydroxyl free radical and superoxide anion of 1mg/mL chitooligosaccharide－selenium were 40.27%and 38.68%，and the total antioxidant activity was 0.617 Unit/mL.This research was an important step as means of laying the foundation for further research on low toxicity and effective organic selenium products.Key words:chitooligosaccharide;chitooligosaccharide－selenium;synthesis;characterization;antioxidant activity

R96

A

1009－315X(2012)05－0445－04

2012－02－16;最后

2012－07－02

国家自然科学基金项目(20872013);中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(DC110318，DC10040108)。

金黎明(1979－)，女，黑龙江牡丹江人，副教授，博士，主要从事生物活性物质研究。

(责任编辑 邹永红)