24个桉树品系遭受桉树枝瘿姬小蜂危害后防御酶活性变化

王 伟, 徐建民，李光友，韩 超，吴世军，陆钊华

(中国林业科学研究院 热带林业研究所，广东 广州 510520)

24个桉树品系遭受桉树枝瘿姬小蜂危害后防御酶活性变化

王 伟, 徐建民，李光友，韩 超，吴世军，陆钊华

(中国林业科学研究院 热带林业研究所，广东 广州 510520)

选取对桉树枝瘿姬小蜂不同抗性的24个桉树品系，对其遭受危害过程中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）活性变化进行测定。结果表明：受害前，桉树叶片内SOD活性、POD活性和PPO活性均表现为高抗品系＞中抗品系＞高感品系；在遭受桉树枝瘿姬小蜂危害后，叶片内SOD活性和PPO活性表现为先升高后下降的趋势；升高增量排名前三的品系是：柠檬桉、粗皮桉和Et12；活性下降排名前三的是Et09、DH32-29和KX12；POD活性表现为持续升高并趋于稳定的趋势，升高增量排名前三的是A107、T121和DH42-6；方差分析表明：桉树叶片内防御酶活性的变化在不同抗性品系间差异显著，表现为高抗品系＞中抗品系＞高感品系。

桉树品系；桉树枝瘿姬小蜂；超氧化物歧化酶；过氧化物酶；多酚氧化酶

桉树枝瘿姬小蜂Leptocybe invasa Fisher& La Salle属膜翅目Hymenoptera姬小蜂科Eulophidae,是严重危害桉树一些品种的枝瘿性害虫。2000年首次发现与中东及地中海沿岸国家，2007年在我国广西壮族自治区首次被发现[1-3]。该虫在桉树的嫩枝、嫩茎、叶柄及叶脉上产卵，形成虫瘿，导致植株枝叶变形、矮化、呈丛枝状，严重影响桉树生长[4]。

目前，对于桉树枝瘿姬小蜂的化学防治效果不理想，应用抗虫品种是该病最经济有效的防治措施[5]。有研究发现，植物在被植食性害虫取食后，会发生一些主动反应，包括细胞过敏性坏死、植保素、酚类、醌类物质等次生产物的合成、寄主细胞壁的加强和修饰等[6-7]。植物的这种主动防卫反应与植物体内的多种酶的活性密切相关。其次，植物在遭受害虫侵害后，常会引起植物光合速率下降，并且诱导植物产生防御蛋白或防御酶升高[8]，这些防御酶主要包括超氧化物歧化酶（superxide dismutase,SOD）、过氧化物酶（peroxidase,POD）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）等。

本实验选取24个桉树品系，在模拟自然状态下桉树枝瘿姬小蜂的危害过程，获得不同品系的抗性能力，在此基础上通过测定桉树叶片内超氧化物歧化酶、过氧化物酶和多酚氧化酶活性变化，了解桉树受害后的应激反应，揭示桉树受害后其植株体内防御酶的变化规律，旨在探讨自然状态下桉树应对枝瘿姬小蜂的抗性机制，为后续开展抗逆新品系选育奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

表1 参试桉树品系一览表Table 1 List of the varieties of Eucalyptus in the trial

1.2 方法

1.2.1 取样

本实验于中国林业科学研究院热带林业研究所苗圃进行，参试品系各30株，移栽于大小为30 cm×20 cm的塑料盆内，其中10株作为对照，用纱网隔离。其余六株，自然环境下生长。4月份开始取样，每个月上旬取生长健壮株第3或第4展开叶（自上而下），每株三次重复，即每株取样约2 g左右，在植株未发生死亡等情况下，保持同株取样，叶片用液氮速冻保存，连续取样5个月。

1.2.2 测定

超氧化物歧化酶活性的测定，采用氮蓝四唑（NBT）光还原法[9]。过氧化物酶活性的测定 采用愈创木酚法[9]。多酚氧化酶活性的测定 采用三氯乙酸比色法[10]。

1.3 数据处理

采用Excel 2007软件对数据进行行录入及核对，应用SAS 8.0软件对数据进行统计分析[11]。

2 结果与分析

2.1 不同桉树品系对桉树枝瘿姬小蜂的抗性

2011年4月开始每个月调查参试品系受桉树枝瘿姬小蜂危害情况。根据其危害情况，将参试品系分为高抗、中抗和高感3个类别。24个参试品系中，尾叶桉3个品系A107、T121和D48，细叶桉品系Et16，以及窿缘桉、邓恩桉、柠檬桉、大花序桉、M1、GL9在调查的5个月期间，未受到桉树枝瘿姬小蜂危害，评定为高抗品系；细叶桉品系Et12、Et09和巨桉3个品系KX8、KX3、KX12， 以 及 雷 11、DH19-6、LH1雷 9、DH42-6、DH32-26和DH32-29在桉树枝瘿姬小蜂危害高峰期，出现不同程度危害症状，对桉树的生长产生了一定的影响，但均未形成虫瘿，评定为中抗品系；窿缘桉和DH201在5月份开始进入小蜂危害高峰期，植株产生大量的虫瘿，严重阻碍了桉树的生长发育，评定为高感品系。

2.2 桉树不同品系叶片内过氧化物酶活性的动态变化

桉树不同品系受桉树枝瘿姬小蜂胁迫前后，叶片中过氧化物酶（POD）活性变化的柱形图可以看出（图1），在未在遭受桉树枝瘿姬小蜂危害前，叶片内的POD活性：高抗品系＞中抗品系＞高感品系，高抗品系和中抗品系叶片内POD活性显著高于高感品系，高抗品系叶片内POD活性高于高感品系，但差异不显著；随着桉树枝瘿姬小蜂危害加剧，桉树叶片内POD活性呈逐月上升的趋势，8月份测定数据表明，最大升高幅度达到受害前的180%，通过与对照相比，高抗品系叶片内POD活性上升趋势高于高感品系。方差分析结果表明：不同品系同一月叶片内POD活性差异显著，同一品系不同月份间叶片内POD活性变化差异显著（表2）。

图1 不同桉树品系在遭受桉树枝瘿姬小蜂后POD活性变化Fig.1 Variation of POD in leaves of Eucalyptus with different resistance after invasion

2.3 桉树不同品系超氧化物歧化酶活性的动态变化

不同桉树品系叶片中超氧化物歧化酶活性的变化见图2，可以看出，桉树品系在遭受桉树枝瘿姬小蜂危害前（即4月初），高抗品系、中抗品系叶片中SOD活性显著高于高感品系， 中抗品系DH32-26、DH32-29、DH19-6以及雷11叶片中SOD活性显著低于高抗品系，其他中抗品系叶片中SOD活性与高抗品系差异不显著。随着时间推移，在桉树枝瘿姬小蜂胁迫下，叶片中的SOD活性产生明显的动态变化。从总体变化趋势看，所有品系叶片中SOD活性都呈现先上升后下降的趋势，在小蜂危害初期，叶片中SOD活性迅速上升，上升幅度最高的达到50%，随着小蜂危害加剧，到6月份，一部分品系叶片中SOD活性继续升高，而部分叶片的SOD活性开始下降，进入7、8月份，叶片中SOD活性整体呈现下降趋势，中抗品系Et09和Et12例外，其叶片中SOD活性持续升高。通过比较发现，高感品系叶片中SOD活性下降到低于危害前水平，而大部分高抗品系、中抗品系叶片中SOD活性虽出现下降，但均未低于危害前水平。

表2 不同桉树品系叶片POD、SOD和PPO酶活性方差分析†Table 2 Variance anlysis and test of activities of POD,SOD and PPO among different strains

图2 不同桉树品系在遭受桉树枝瘿姬小蜂后SOD活性变化Fig.2 Variation of SOD in leaves of Eucalyptus with different resistance after invasion

2.3 桉树不同品系多酚氧化酶活性的动态变化

由图3可知，4月份，即桉树不同品系在受桉树枝瘿姬小蜂危害前，感病品系多酚氧化酶活性（PPO）显著低于高抗品系和中抗品系。5月份，进入桉树枝瘿姬小蜂危害期，叶片内PPO的活性升高，尤其是Et12、Et09、KX-12、广9和粗皮桉5个品系PPO活性迅速升高，其PPO活性均达到受害前的1.5倍以上，随着小蜂危害加剧，不同桉树品系叶片内PPO活性继续升高，如A107、T121、D48等，同时，一些品系叶片内PPO活性开始下降，如Et09，粗皮桉等，这说明叶片内PPO活性随危害时间变化不一致。从PPO活性动态变化的柱形图可以看出：叶片内PPO活性都在5、6、7月份达到最高点，然后开始降低，但均高于其受害前水平。感病品系窿缘桉和DH201-2叶片内PPO活性在不同月份均显著低于高抗品系和中抗品系；中抗品系Et09、DH32-26、DH19-6和雷11叶片内PPO活性显著低于高抗品系，并显著高于高感品系叶片内PPO活性，其余中抗品系叶片内PPO活性和高抗品系之间差异不显著。

图3 不同桉树品系在遭受桉树枝瘿姬小蜂后PPO活性变化Fig. 3 Variation of PPO in leaves of Eucalyptus with different resistance after invasion

3 结论与讨论

SOD、POD和PPO都是普遍存在于植物体内与植物抗逆性密切相关的代谢酶，许多研究者认为，它们在植物抗病虫中有重要意义，与植物的抗病虫能力有着密切的关系[12-14]。

SOD和POD是植物体内重要的活性氧防御酶，植物在正常状态下，体内活性氧的产生与消除处于平衡状态，因此防御酶体系也相对稳定[15]。当植物遭遇逆境时，产生大量的活性氧，可导致蛋白质、膜脂、DNA及其它组分的严重损伤，因此，活性氧的清除对于维持正常的功能具有重要的意义，超氧物歧化酶能将O2-转化为毒性较小的H2O2和O2，而过氧化物酶又可进一步清除H2O2生成无害的H2O和O2，从而完成对生物体的保护作用[16]。本实验研究结果表明：24种不同桉树品系在遭受桉树枝瘿姬小蜂危害后，叶片内SOD活性和POD活性都产生了显著变化。在受害前，桉树叶片内SOD活性、POD活性和PPO活性均表现为高抗品系＞中抗品系＞高感品系；受到小蜂危害后，叶片内POD活性持续升高，升高增量排名前3的是A107、T121和DH42-6；叶片内SOD活性出现先升高后下降的趋势，升高增量排名前3的品系是：柠檬桉、粗皮桉和Et12。方差分析表明：桉树叶片内防御酶活性的变化在不同抗性品系间差异显著，表现为高抗品系＞中抗品系＞高感品系。

PPO在植物抗逆性反应中发挥着重要作用，可催化木质素及其他酚类氧化产物的形成，构成保护性屏蔽[17]；同时，当细胞受轻微破坏或组织衰老时，酚氧化酶与底物接触，发生反应形成棕褐色的醌，而醌类有对昆虫进行化学防御的生态功能，不利于昆虫的取食和消化，有涩味，昆虫不喜欢取食，可防止植食性昆虫的侵食，所以多酚氧化酶高的林木表现为抗虫，反之，感虫[18-19]。本研究对24个桉树品系在遭受小蜂前后，叶片内PPO活性的变化进行测定，结果表明，高抗品系、中抗品系叶片内PPO活性明显高于高感品系，在受到小蜂危害后PPO活性升高，说明桉树在遭受枝瘿姬小蜂侵害后，PPO活性被激活，参与了植物的自身保护机制；而在遭受危害一段时间后，叶片内PPO活性出现下降，但高于危害前活性水平，这可能是由于桉树叶片对该蜂危害产生的较快的应激反应，而后逐渐趋于稳定。程璐等在研究苜蓿斑蚜对5种苜蓿品种防御酶活性的影响、武德功在研究不同苜蓿品种对豌豆蚜的生化抗性机制时都得出了PPO活性先下降后上升的变化趋势[20-22]，程璐认为PPO活性降低可能是受抗蚜虫基因的控制；武德功等认为PPO活性降低是被蚜虫唾液分泌物所抑制，笔者认为植物遭受害虫危害后，植物叶片内PPO活性升高是植物一种正常的应激反应过程，但为何在桉树叶片内PPO活性表现为先升高后下降的趋势，是否是因PPO活性受到桉树体内抗性基因控制，将在抗性基因筛选过程中进一步求证。

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Defense enzyme activity of 24 Eucalyptus varieties jeopardized by Leptocybe invasa Fisher & La Salle

WANG Wei, XU Jian-min, LI Guang-you, HAN Chao, WU Shi-jun, LU Zhao-hua
(Research Inctitute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520, Guangdong, China)

∶ 24 different resistant Leptocybe invasa Eucalyptus varieties were selected to study the effects of Leptocybe invasa hazards on the varieties activites of superxide dismutase, peroxidase and polyphenol oxidase. The results show the variation tendency of SOD,POD and PPO was a descending order: ‘high-resistant varieties, middle-resistant ones and high-sensitive ones before varieties were determined by Leptocybe invasa Fisher& La Salle. The activities of SOD and PPO in all varieties initially increased then declined when the varieties were invaded by Leptocybe invasa. The top three varieties of incremental increase were E. Citriodora, E.pellita and ET12.The top three which declines are Et09、DH32-29 and KX12. The activities of POD in all varieties initially increased to stabilize. The top three varieties of incremental decrease were A107、T121 and DH42-6.Variance analysis shows that there existed a huge difference of activities of defense enzymes’ variation between the high-resistant and high-sensitive. Activities of defense enzymes can be used as a biological and chemical target to assess the resistance of Eucalyptus to Leptocybe invasa.

∶ Eucalyptus varieties; Leptocybe invasa Fisher& La Salle; superxide dismutase; peroxidase; polyphenol oxidase

S763.43

A

1673-923X(2012)06-0024-05

2012-03-12

国家科技支撑计划项目“高产、抗逆桉树新品种选育”(2012BAD01B0401); 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(RITFYWZX200904), 广东省林业科技创新专项资金项目“桉树良种选育和高效栽培技术研究与示范”(2009KJCX004-02)

王 伟(1983—)，男，山西临汾人，博士研究生，主要研究方向：桉树抗性育种

徐建民(1964—)，男，云南楚雄人，研究员，博导，主要从事热带林木遗传育种研究；E-mail: jianmxu@163.com

[本文编校：吴 彬]