小鼠卵子老化过程中皮质颗粒的变化和自发孤雌激活的研究

杨尚武 黄 浩 王小婕 朱秀兰 宋亚丽 修良昌 邢福祺

1.南方医科大学附属南方医院妇产科生殖中心(广州，510515);2.南方医科大学附属南海医院;3.广东医学院公共卫生学院统计学教研室

·基础研究·

小鼠卵子老化过程中皮质颗粒的变化和自发孤雌激活的研究

杨尚武1，2黄 浩2王小婕2朱秀兰1宋亚丽1修良昌3邢福祺1

1.南方医科大学附属南方医院妇产科生殖中心(广州，510515);2.南方医科大学附属南海医院;3.广东医学院公共卫生学院统计学教研室

目的:通过卵子老化过程中皮质颗粒的变化和自发孤雌激活比例，探讨老化卵子受精异常的原因。方法:对8～10周龄雌鼠注射孕马血清促性腺激素和绒毛膜促性腺激素14h后，于不同时间段取出MII期成熟卵子分作体内不同时间老化组(MII+0h、MII+6h、MII+12h、MII+18h);成熟M II+0h卵子取出后体外分别培养6h、12h、18h作为体外老化组。对各组卵子免疫荧光染色，共聚焦显微镜成像显示染色体形态和皮质颗粒分布。体内各组卵子取出后继续体外培养8h统计自发孤雌激活的比例和碎裂卵子数。结果:体内和体外MII+12h、MII+18h组自发皮质颗粒排放比例和皮质颗粒内迁数明显高于MII+0h、MII+6h组。体外MII+18h组自发皮质颗粒排放比例和皮质颗粒内迁数低于体内MII+18h组。体内MII+12h、MII+18h组卵子取出继续体外培养8h后孤雌激活比例和死亡比例明显高于体内MII+0h和MII+6h组。结论:卵子在老化过程中存在皮质颗粒自发排放和皮质颗粒内迁，以及自发孤雌激活和碎裂化，这些因素均可能导致老化卵受精能力的降低。卵子老化过程中皮质颗粒排放和内迁可能受到体内环境的影响。

小鼠 卵子 老化 皮质颗粒 孤雌激活

排卵后老化是指当卵母细胞到达第二次减数分裂中期(MⅡ)后，因未能受精，减数分裂不能继续完成，而持续停滞在这一阶段所发生的老化。卵母细胞的老化会导致妊娠率降低、流产率增加和出生缺陷。研究排卵后卵母细胞老化过程及机制，探讨延缓卵母细胞老化的有效措施，对于改进卵母细胞体外成熟和受精系统，完善辅助生殖技术并减少出生缺陷具有重要的理论价值。既往研究显示，皮质颗粒(CG)是卵子成熟和检验卵子质量的重要指标。本研究通过观察超排的小鼠成熟卵不同老化时间和老化环境下的CG变化以及老化卵体外培养自发孤雌激活的改变，探讨卵母细胞老化的变化规律及对受精和发育产生影响的可能因素。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂、仪器

雌鼠购自北京大学北校区实验动物中心。孕马血清促性腺激素(PMSG)和绒毛膜促性腺激素(hCG)购自宁波制药厂。其他主要试剂和仪器有:碘化丙啶(PI)，异硫氰酸荧光素络合小扁豆凝集素(FITCLCA)(Sigma公司，美国);M2操作液、M16培养液、胎牛血清(Gibco公司，美国);leica解剖显微镜(莱卡公司，德国);ZEISS－510 META激光共聚焦显微镜(蔡司公司，德国)。

1.2 实验方法

1.2.1动物处理和分组8～10周ICR品系雌鼠于发情后期腹腔注射PMSG 10U，48h后腹腔注射hCG 10U，推定hCG注射14h后为卵子体内成熟MII期。分别于MII期后不同时间采取断颈法处死小鼠，取出卵子，作为体内不同时间老化组(MII+0h、MII+6h、MII+12h、MII+18h);另一批小鼠 MII期断颈处死取出卵子后，置入M16培养液于CO2培养箱培养6h、12h、18h，作为体外老化卵组。卵子获得:取出子宫输卵管，挑破输卵管膨大部位，得到卵丘复合物(COC)。用0.1%透明质酸酶消化颗粒细胞后得到MII卵，M2操作液洗3遍，转入Tyrode酸性液消化透明带，进行CG荧光染色。

1.2.2卵子CG荧光染色卵子去掉透明带后，4%多聚甲醛固定30min，于含0.3%胎牛血清蛋白(BSA)和100mmol/L甘氨酸的PBS液(阻断液)中洗3次，含0.1%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX－100)的PBS(透膜液)中透膜5 min，再次置入阻断液中洗3次。100μg/ml FITC－LCA(以PBS稀释)避光孵育45min。含0.3%BSA和0.01%TritonX－100的PBS(洗脱液)洗3次，10μg/ml PI暗室环境下染核10min。DABCO封片，置于激光共聚焦显微镜上，用激发波长488nm光观察。成熟CG分布标准:卵子赤道面CG排布在质膜下，形成单层细致的光环，从皮质面观察可见CG的分布细致均匀。CG排放的标准:卵子赤道面质膜下CG光环断裂、不连续、伴凝集，从皮质面观察可见CG凝集成团块状、分布不均匀。CG内迁的标准:卵子赤道面CG数目≥6个。

1.2.3卵子老化自发孤雌激活的观察按上述方法取得各不同时间组老化卵子后，置入M16培养液于37℃ 5%CO2的培养箱中8h，倒置显微镜下统计分化到2细胞卵子数和碎裂卵子数。

1.3 统计分析

每组至少3次独立重复实验，数据用平均数表示;以SPSS17.0软件进行logisitic回归分析和χ2检验。

2 结果

2.1 卵子CG荧光染色

图1A显示新鲜成熟卵子CG的分布:从皮质面观察可见CG的分布细致均匀;从赤道面观察可见CG形成单层细致连续的光环，且胞浆内无CG。图1B显示老化卵子已排放CG:从皮质面观察可见CG凝集成团块状、分布不均匀;在赤道面质膜下CG光环断裂、不连续、伴凝集，且CG内迁至胞浆内。

图1 成熟卵子(A)及老化卵子(B)CG分布

2.2 卵子老化不同时间CG排放和内迁

体内成熟卵子在体内和体外老化MII+12h、MII+18h组与MII+0h组相比，CG排放和内迁均有明显变化。见表1。以是否发生CG排放反应作为应变量，以实验类型(体内、体外)和时间点作为自变量进行logisitic回归分析，结果实验类型和时间均有统计学意义。体内与体外相同老化时间组比较，只有MII+18h组CG排放有明显变化(P＜0.05)。以是否发生CG内迁作为应变量，以实验类型(体内、体外)和时间点作为自变量进行logisitic回归分析，结果时间有统计学意义，实验类型无统计学意义。

2.3 卵子老化自发孤雌激活

体内MII+12h和MII+18h组卵子继续体外培养8h，孤雌激活2细胞数和碎裂卵子数明显高于体内MII+0h和MII+6h组。见表2。

表1 卵子老化不同时间各组CG排放和内迁情况比较［例(%)］

表2 体内各组继续体外培养8h后卵子情况比例［例(%)］

3 讨论

小鼠卵母细胞成熟排卵后停滞于MII期，此间如果有精子穿入则会恢复减数分裂形成受精卵开始发育进程。如果没有精子穿入则会发生细胞质与细胞核的一系列变化，最终导致卵母细胞的老化。老化卵母细胞受精能力和发育能力均明显下降，甚至出现不受精的情况，其受精产生的后代繁殖性能和寿命亦较正常卵差［1，2］。卵母细胞的老化机制是什么，在老化过程中究竟发生了哪些变化，如何客观评价卵子老化的程度和状态，进而分析受精失败的原因，一直是临床工作面临的难题。本研究通过观察卵子老化过程CG变化、孤雌激活和卵子死亡碎片变化来探讨老化卵对受精的影响。

3.1 CG在卵子发育成熟和老化过程中的变化

CG是大多数哺乳动物卵母细胞所特有的直径为0.2～0.6μm 的圆形颗粒结构，在细胞质中的分布随卵母细胞的生长发育呈明显的变化。其合成初期随机分布于细胞质中，之后逐渐向皮质区迁移，于排卵前呈单层分布于质膜下，并形成约占皮质40%的无CG区。这一过程由微丝介导［3，4］。卵母细胞成熟过程中的CG迁移及在皮质区的重新分布，是判断卵母细胞胞质成熟的一项重要指标。CG是防止多精子受精、保证正常受精的一种重要细胞器。研究卵子老化过程中CG这一细胞器的改变，亦可能是判断卵子胞质质量和卵子质量的重要指标。本研究中发现体内成熟卵子在体内和体外老化12h后均存在较高比例CG自发排放和内迁过程。Díaz等［5］研究发现新鲜成熟卵体外受精发育至2细胞比例达66.3%，当用老化20h卵行体外受精时这一比例降至16.85%。新鲜卵子透明带厚6～7μm，为均一结构，而老化20h卵子部分透明带内层变得致密，而外层相对透明。PTA染色显示82.14%老化卵透明带内层明显深染，外层相对淡染，均呈带状结构，电子显微镜提示老化卵卵周隙明显加大。老化卵子透明带消化时间明显增加，提示透明带硬化，老化卵子受精率下降可能与这一反应有关［5，6］。本研究观察到老化卵中存在自发CG排放的现象。自发排放的CG可能激活了透明带反应，阻止老化卵子受精，从而避免老化卵对受精质量的不良影响，这可能是生物自发保护机制之一。有研究［7］发现促分裂原活化蛋白激酶在老化卵中活性明显下降，可能是CG自发排放的原因。

3.2 老化卵孤雌激活和卵子死亡碎片化

卵子孤雌激活是指阻滞在第2次减数分裂中期的卵母细胞在某些理化因子的作用下活化而启动由卵母细胞自身控制的孤雌发育。在卵子受精或孤雌激活过程中有类似的激活机制:细胞内钙离子增加，细胞静止因子(CSF)和成熟促进因子(MPF)水平下降，卵母细胞离开MII期，完成减数分裂，进入胚胎发育［7，8］。本研究结果发现:体内老化卵子 MII+12h和MII+18h组卵子取出后继续体外培养8h后孤雌激活2细胞和碎裂卵子数明显高于MII+0h组，表明不同老化时期卵子随着老化时间延长孤雌激活比例明显增加。卵细胞孤雌激活一方面可能会诱导CG自发排放，降低受精能力，另一方面提示卵子老化到一定时段胞质和遗传物质已经在无精子诱发前提下自发启动有丝分裂周期，从而阻止精卵融合发育成合子的可能。在小鼠老化MII+12h和MII+18h组中卵子碎片率增加，提示部分老化卵子已经在受精前启动了凋亡过程。

3.3 卵子老化与周围环境关系

排卵后的卵子周围包裹着颗粒细胞，颗粒细胞加速卵子老化过程。含有颗粒细胞的体内老化卵其MPF活性较无颗粒细胞体外老化卵下降明显，当体外老化卵与颗粒细胞共培养后，MPF活性下降明显加快，激活概率明显增加［9］。丙酮酸可以减缓颗粒细胞引起的老化进程［10］。本研究显示:在体内与体外相同老化时间组比较，体内老化18h组CG自发排放比例高于体外组，提示与体外培养环境相比，体内输卵管环境更容易导致卵子老化，老化卵子CG排放可能受到体内颗粒细胞的影响，颗粒细胞可以加速卵子自发CG排放过程。

总之，本研究结果显示，小鼠卵子成熟后12h即可见老化现象，即CG自发排放，自发排放的CG可能进而激活了透明带反应，阻止老化卵子受精，从而避免老化卵对受精质量的不良影响。这可能是生物自发保护机制之一。老化卵随时间延长孤雌激活比例、卵子碎片死亡率也明显增加。卵细胞孤雌激活一方面可能会诱导CG自发排放，降低受精能力，另一方面可阻止精卵结合。卵子发生碎片化死亡亦是老化卵受精异常的原因之一。

1 Andreu － Vázquez C，López － Gatius F，García － Ispierto I，et al.Does heat stress provoke the loss of a continuous layer of cortical granules beneath the plasma membrane during oocyte maturation［J］?Zygote，2010 ，18(4):293－299.

2 Tarín JJ，Pérez－ Albalá S，Pérez－ Hoyos S，et al.Postovulatory Aging of Oocytes Decreases Reproductive Fitness and Longevity of Offspring［J］.Biol Reprod，2002，66(2):495 －499.

3 Wang WH，Sun QY，Hosoe M，et al.Quantified analysis of cortical granule distribution and exocytosis of porcine oocytes during meiotic maturation and activation［J］.Biol Reprod，1997，56(6):1376 －1382.

4 Liu XY，Mal SF，Miao DQ，et al.Cortical granules behave differently in mouse oocytes matured under different conditions［J］.Hum Reprod，2005，20(12):3402 －3413.

5 Díaz H，Esponda P.Postovulatory aging induces structural changes in the mouse zona pellucida［J］.J Submicrosc Cytol Pathol，2004，36(2)，211 －217.

6 Dodson MG，Minhas BS，Curtis SK.Spontaneous zona reaction in the mouse as a limiting factor for the time in which an oocyte may be fertilized［J］.J In Vitro Fert Embryo Transf，1989，6(2):101 －106.

7 Fan HY，Sun QY.Involvement of mitogen－activated protein kinase cascade during oocyte maturation and fertilization in mammals［J］.Biol Reprod，2004，70(3):535 －547.

8 Tunquist BJ，Maller JL.Underarrest:cytostatic factor(CSF) －mediated metaphase arrest in vertebrate eggs［J］.Genes Dev，2003，17(6):683－710.

9 Miao YL，Liu XY，Qiao TW，et al.Cumulus cells accelerate aging of mouse oocytes［J］.Biol Reprod，2005，73(5):1025 －1031.

10 Liu N，Wu YG，Lan GC.Pyruvate prevents aging of mouse oocytes［J］.Reproduction，2009，138(2):223 －234.

Cortical granule change and spontaneous parthenogenetic activation during mouse oocytes aging

Yang Shangwu1，2，Huang Hao2，Wang Xiaojie2，Zhu Xiulan1，Xiu Liangchang3，Xing Fuqi1
1.Center of Reproductive Medicine，Southern Hospital Affiliated to Southern Medical university，Guangzhou510515;2.Nanhai Hospital Affiliated to Southern Medical university;3.School of Public Health，Guangdong Medical University.

Objective:To explore the cortical granule(CG)change and parthenogenetic activation during mouse oocyte aging.Methods:Female mice，8－10 weeks of age，were induced to superovulation with pregnant mare serum gonadotropin(PMSG;10U，i.p.)followed 48 h later by hCG(10 U，i.p.).Oocytes were retrieved at different time intervals(MII+0h，+6h，+12h，+18h)(in vivo aging)or MII+0h oocytes cultured for different time periods(+6h，+12h，+18h)(in vitro aging).CG distribution and release were assessed by fluorescene isothiocyanate－labelled Lens culinaris agglutinin(FITCLCA)staining and laser confocal microscopy.Spontaneous parthenogenetic activation and fragmentation of oocytes were observed after anther 8h of culture of different in vivo aging groups.Results:Spontaneous cortical granule exocytosis(CEG)and CG inward movement rates in MII+12h，MII+18h groups were statistically higher than those in MII+0h，MII+6h groups in both in vivo and in vitro aging oocytes.Spontaneous CGE and CG inward movement in M+18h group was lower in in－vitro aging group than those of in vivo aging counterpart.Spontaneous parthenogenetic activation and oocyte fragmentation ratios after further 8h of culture were higher in MII+12h，MII+18h groups than those in MII+0h，MII+6h groups.Conclusion:Spontaneous CGE and CG inward movement increased during oocyte aging both in vivo and in vitro.There were also increased parthenogenetic activation and oocyte fragmentation ratios as oocyte aged.All these may cause the low fertility of aged oocyte.Spontaneous CGE and CG inward movement may be accelerated by maternal environment changes.

Mouse;Oocyte;Cortical granule;Aging;Parthenogenetic activation

10.3969/j.issn.1004 －8189.2012.11

国家自然科学基金项目(编号:30930065)

2012－04－23

2012－07－08

［责任编辑:王丽娜］