长航对人体外周血细胞因子表达水平的影响

熊 鸣，赵晓航，朱智明，解 鹏，乔媛媛，安怀杰，曲 佳，何立东

长航对人体外周血细胞因子表达水平的影响

熊 鸣，赵晓航，朱智明，解 鹏，乔媛媛，安怀杰，曲 佳，何立东

目的 探讨执行海上编队长航任务对舰员外周血细胞因子表达水平的影响。方法 采用多抗体芯片化学发光法定量比较海上任务人员(实验组)和岸基人员(对照组)外周血120种细胞因子的表达差异。结果 与岸基人员相比，执行海上长航任务舰员外周血34．17%(41/120)人体细胞因子表达水平改变，其中13种细胞因子表达升高，涉及Janus激酶-信号转导及转录活化因子、有丝分裂原活化蛋白激酶等细胞信号通路，参与细胞趋化、免疫调节(尤其是细胞免疫调节)、炎症反应和细胞凋亡等重要生物学过程。结论执行海上编队长航任务124 d，部分舰员外周血多种细胞因子表达水平改变，提示海上综合作业环境在一定程度上影响长远航任务人员机体免疫功能。

细胞因子;抗体芯片;免疫调节;长航

细胞因子(cytokine，CK)是指由活化免疫细胞或非免疫细胞合成分泌的能调节细胞生理功能、介导炎症反应、参与免疫应答和组织修复等多种生物学效应的小分子多肽，是除免疫球蛋白和补体之外的又一类分泌型免疫分子［1］。细胞因子检测是判断机体免疫功能的一个重要指标。已有文献报道，由于长航特殊的作业环境，舰员经常遭遇生理和心理上的双重障碍，主要表现在免疫功能失衡、血液组分和代谢改变、内分泌调节紊乱、精神抑郁等［2-3］。因此，采用抗体芯片技术高通量地观察舰员在海上长航综合因素作用下，外周血细胞因子广谱改变，有助于从分子水平认识长航对机体尤其对免疫功能的影响，为长航卫勤保障提供理论依据［4-6］。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器 一次性真空采血管和二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA蛋白定量试剂盒购自BioRad公司;人细胞因子抗体芯片(Human cytokine antibody array C series 1000)试剂盒为美国Ray-Biotech公司产品;低速冷冻离心机为美国Thermo公司产品;扫描仪Uniscan D1000为清华紫光股份有限公司产品;芯片数据提取软件Imagene 6.0为BioDiscovery公司产品。

1.2 实验对象与分组 ①实验组:执行海上任务舰

员20名，连续海上航行124 d，年龄(21.25±1.13)岁，均为男性。根据人员训练背景和执行任务不同，分为实验1组和实验2组，每组各10名。于返航靠岸后次日清晨，空腹于肘正中静脉采集促凝血2 ml，常规分离血清后，迅速低温下分装，于－80℃保存。②对照组:以岸基部队人员作为对照组，共12名，年龄(21.33±1.27)岁，均为健康男性。采血时间和处理方式同实验组。

1.3 待测血清样本准备 分别等量混合来自实验1组、2组各10名舰员和对照组12名岸基人员血清样本，形成实验组和对照组血清混合样本池。BCA法蛋白定量后，1×封闭缓冲液稀释，使其蛋白浓度在 50 ～500 μg/ml。

1.4 抗体芯片检测细胞因子 采用人细胞因子抗体芯片 RayBio®Human Cytokine Antibody Array C Series 1000，通过化学发光法同时定量检测上述3组混合样本中120个细胞因子的蛋白表达水平。实验过程简述如下:每组血清样本同时与2张硝酸纤维素膜杂交，每张膜上含有60种不同抗体，每种抗体均设有2个重复对照，其中包含阳性对照、阴性对照和空白对照。芯片经封闭后，分别与等量的3组混合血清样本共孵育，洗膜，依次与生物素标记的针对不同蛋白的特异性抗体和偶联有辣根过氧化物酶的抗链霉生物素抗体进行杂交反应，然后经增强型化学发光(electro chemi luminescence，ECL)试剂显影、X-线曝光等过程，获得杂交后的斑点图，扫描图像并保存为灰度标签图像文件格式(tagged image file format，TIFF)图片。

1.5 数据提取和转换 各细胞因子的蛋白表达水平以杂交后对应斑点的平均灰度值表示。运行Imagene 6.0软件，将该图片中的点阵转化为数字型数据，作为原始数据并储存。以空白对照对应的平均灰度值作为本底，原始数据扣除本底后，通过阳性对照进行标准化处理，计算实验组与对照组中对应细胞因子的标准化数据比值，即代表两者的差异表达倍数。将差异表达倍数＞1．3或＜0．77的细胞因子定义为差异蛋白。

1.6 差异蛋白的功能分析 通过基因注释(gene ontology，GO)数据库明确差异蛋白的分子功能及主要参与的生物学过程，通过京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and enomes，KEGG)数据库定位差异蛋白所在的主要代谢通路，并分别归类。

2 结果

2.1 长航引起人体血清细胞因子的表达改变 来自3组多个个体的混合血清样本分别与含有120个人类细胞因子的抗体芯片杂交。结果显示，与对照组相比，实验组血清细胞因子的表达发生了明显改变，差异表达＞1.3或＜0.77倍的细胞因子共有41个(34.17%，47/120)。其中，以干扰素诱导的T细胞α趋化因子(interferon-inducible T cell alpha chemoattractant，I-TAC)和生长调节癌基因-α(growth related oncogene-alpha，GRO-α)变化最为显著，其蛋白表达水平分别上调或下调了2.16倍和0.44倍。在41个差异细胞因子中，实验1组中有32个(26.67%，32/120)差异细胞因子，17个表达上调、15个表达下调;实验2组中有26个(21.67%，26/120)差异细胞因子，均呈表达上调(表1)。两组中共有17个(14.17%，17/120)相同的差异细胞因子，其中，除4个细胞因子在两组中表达改变不一致外，其余13个细胞因子均呈一致性表达升高(表2，图1)。

表1 实验1、2组细胞因子数量

表2 一致性差异表达细胞因子列表

图1 抗体芯片显示一致性差异表达细胞因子

2.2 差异细胞因子的功能分析 分别检索GO数据库和KEGG数据库，将长航组中上述一致性表达升高的细胞因子进行功能分析并归类。结果如表3所示，13个差异细胞因子主要与细胞运动(8/13，61.54%)和细胞生长调节(5/13，38.46%)密切相关。其中，前者以趋化因子(6/13，46.15%)为主，后者包括生长因子及其受体(3/13，23.08%)与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(2/13，15.38%)。涉及细胞因子及其受体相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)、有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、Janus 激酶-信号转导及转录活化因子(janus kinase-signal transducer and transcription，Jak-STAT)和天然杀伤细胞介导细胞毒性(natural killer cell mediated cytotoxicity pathway，NCMC)等信号通路，参与了包括细胞趋化、免疫调节尤其是细胞免疫调节、炎症反应、细胞增殖和凋亡等重要生物学过程。

表3 一致性表达升高的差异细胞因子功能分类

3 讨论

本研究采用人细胞因子抗体芯片定量比较了不同长航人员和岸基人员外周血120种细胞因子表达水平改变。结果显示:与岸基人员对照组相比，执行长航任务后34.17%(41/120)人体细胞因子表达水平发生改变。其中，实验1组和2组差异细胞因子数分别为32(26.67%，32/120)和26(21.67%，26/120)，除13个细胞因子呈一致性表达升高外，两组中其余差异因子及其变化均不相同。由于两组成员都是同批次长航人员，仅在训练背景和任务分工上有所不同，因此研究中重点关注了在两组中呈一致性表达改变的13个差异细胞因子。

进一步功能分类发现，上述13个差异细胞因子主要与细胞运动(8/13，61.54%)和细胞生长调节(5/18，38.46%)密切相关。其中，前者以趋化因子(6/8，46.15%)为主，后者包括生长因子及其受体(3/13，23.08%)与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(2/13，15.38%)。涉及 MAPK、Jak-STAT和 NCMC等信号通路，参与了包括细胞趋化、免疫调节尤其是细胞免疫调节、炎症反应、细胞增殖和凋亡等重要生物学过程。

已知趋化因子是一类由分子质量较小的蛋白(8～16 ku)组成的、有20%～70%的氨基酸同源性的细胞因子超家族。除了具有调节免疫细胞游走、介导免疫反应的功能之外，还涉及到神经退行性疾病的炎症过程，以及参与了与炎症无关的细胞生长调节、血细胞生成、胚胎发育、血管生成等多种生物学过程。研究中发现，呈差异表达的趋化因子在功能上具有共同的特点，即主要表现为较强的T细胞趋化性，与T细胞的定向游走、选择性归巢密切相关，在免疫调节尤其是细胞免疫调节以及T细胞介导的炎症反应中具有重要作用。例如I-TAC，在13个差异细胞因子中变化最为显著。它作为T细胞最重要的趋化因子，能够诱导T细胞特别是Th1细胞定向迁移、引发炎症反应，因而有利于Th1细胞免疫反应。同时，I-TAC还参与调控血管生成及激活细胞增殖的过程，不仅能够抑制血管内皮细胞生长，调控血管生成，而且能够加强抗原对T细胞作用促进T细胞增殖的功能。可能在包含T细胞募集的中枢神经系统疾病(如自身免疫性脑脊髓炎、单纯疱疹病毒脑炎)和皮肤病(如过敏性接触性皮炎、扁平苔藓和蕈样霉菌病)中具有重要作用［7-8］。皮肤T细胞吸引趋化因子(cutaneous T cell-attracting chemokine，CTACK)，对记忆性T细胞具有较强的趋化作用，而记忆性T细胞选择性归巢于皮肤，因此在T细胞介导的皮肤炎症反应的启动和维持中发挥关键作用。CTACK在过敏性皮炎和牛皮癣的急慢性皮肤损伤，以及银屑病患者皮损和血清中都有高表达［9］。提示，长航后，人体免疫系统出现失衡，T细胞功能异常活跃，由T细胞介导的细胞免疫应答及炎症反应被广泛激活。而差异细胞因子中细胞生长调节蛋白的表达增高可能是前者引起的反应性增高，考虑与免疫/炎症反应后的组织修复有关。当然，该结论还有待于进一步在大样本群中进行验证。

推测引起上述变化的原因可能与长航特殊的作业环境有关。当今现代化舰船大多具有全球、全天候、远距离和长时间的航行性能。舰船在海上远距离和长期航行时，舰员不仅受到舰船周围环境中各种物理、化学因素的影响，而且还受到航海条件对心理因素的影响。首先，茫茫大海危机四伏，舰员不仅要保障自身安全，通常还肩负着某些重要使命，因此超负荷的训练强度和作业任务是对舰员身体的严峻考验，不能排除舰员罹患某些感染或慢性疾病的可能;其次，复杂的海洋水文气象条件，舰上狭小的工作空间，相对贫乏的饮食补给，以及有限的医疗卫生条件，也是威胁舰员健康的不利因素;最后，长期紧张的精神状态，相对单一的生活环境，在身体疲劳之外，舰员往往还面临着内分泌紊乱以及焦虑、抑郁等多种心理障碍。这种“人-舰艇-环境”的综合因素长期作用容易对机体产生叠加和累积效应，影响舰员的免疫乃至整个生理功能，进而导致工作能力下降，发生疲劳和过劳，甚至引起疾病。

慢性疲劳综合征(chronic fatigue syndrome，CFS)损害免疫系统，患者会感到持续疲劳、免疫力下降，还可能出现记忆力减退、注意力难以集中、关节和肌肉疼痛、头疼、淋巴结节、喉咙酸痛等症状［10］。认识长远航作业中“人-舰艇-环境”综合因素对机体影响的特殊性和复杂性，积累科学数据，制定合理的卫勤保障方案，对提高舰员的综合战斗力具有重要意义。本研究发现海上综合作业在一定程度上影响长航任务人员机体免疫功能。提示在执行长远航任务中，除加强任务人员体能训练、营养供给和医疗保障外，还应积极开展心理辅导与卫生常识教育，普及特殊环境对人员影响与防护措施知识，从而提高作业人员保健意识和医学卫生防护水平，减少伤害，降低发病率，增强战斗力。

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Effects of long term voyage of warship on the expression of cytokines in human peripheral blood

XIONG Ming，ZHAO Xiao-hang，ZHU Zhi-ming，XIE Peng，QIAO Yuan-yuan，AN Huai-jie，QU Jia，HE Li-dong
(Center for Basic Medical Science，Navy General Hospital，Beijing 100048，China)

ObjectiveTo investigate the effects of long term voyage of warship on the expression of cytokines in human peripheral blood．MethodsThe RayBio®Human Cytokine Antibody Array C Series 1000 was used to check the expression levels of 120 blood cytokines of warship crew and onshore controls by chemiluminescence hybridization．ResultsAfter the long distance navigation the expression of 34．17%(41/120)cytokines were changed in the blood of the warship crew contrast with the ones onshore controls．Among which，13 kinds of cytokines were increased uniformly，it mainly involved in Jak-ATAT、MAPK and NCMC signal pathways，Which participated in important biology processes such as cell chemotaxis，immunoregulation(especially in cellular immunity regulation)，inflammatory reaction as well as in apoptosis，etc．ConclusionThe integrated factors of"human-warship-environment"during long term voyage can result in changes of the expression of partial blood cytokines，and it may also lead to the disequilibrium of immune function in human body．

Cytokines;Antibody array;Immunological regulation;Long term voyage

R466.61;R821.81

A

2095-3097(2012)01-0013-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2012.01.004

国家自然科学基金(91029725);全军后勤科研计划基金资助(AHJ10L002);海后司令部科研计划基金资助(BHJ09JD11，07-3309)

100048北京，海军总医院基础医学研究中心(熊 鸣，赵晓航，朱智明，解 鹏，乔媛媛，安怀杰，曲 佳，何立东)

赵晓航，E-mail:xhztao@126.com

2012-04-11 本文编辑:徐海琴)