氮、磷、钾对春季桑叶1-脱氧野尻霉素含量和产量的影响

刘 刚，殷 浩，佟万红，黄盖群，王 丽，危 玲，郑继川，夏庆友

（1.西南大学蚕学与系统生物学研究所，重庆400716；2.四川省农业科学院蚕业研究所，四川 南充637000；3.四川省林业科学院，四川 成都610066；4.四川省蚕业科技开发总公司，四川 南充637000）

1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojimycin，DNJ）是一种哌啶类生物碱，一种高效的α-糖苷酶抑制剂，具有显著降血糖的功效［1-3］。而目前所知的天然植物中，桑树（Morusalba）中 DNJ含量最高［4］，而且桑树的主要产物——桑叶，其DNJ含量约为0.1%，是降血糖天然药物开发的优质原料。大量学者［5-12］对桑叶中的DNJ进行了广泛的研究，但大多仅限于其含量，而作为植物生长及代谢的重要因素——肥料却少见相关报道，尤其是配方施肥对桑叶DNJ含量及其总产量的影响，迄今尚未见相关报道。

基于此，本试验初步探讨了“3414”配方施肥对桑叶DNJ含量和产量的影响，并拟合肥料效应函数，获得推荐施肥参数，以期为建设DNJ高产优质桑园提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、仪器和DNJ的测定方法

1.1.1 试剂 1-deoxynojirimycin-HCl（DNJ-HCl）为Sigma公司产品；9-Fluorenylmethyl chlorofor-mate（FMOC-Cl）为Fluca公司产品；乙腈色谱纯为天津市凯通化学试剂有限公司出品；其他试剂皆为分析纯；试验用水为自制双蒸水。

1.1.2 仪器 Dionex 500E型高效液相色谱仪为美国Dionex公司产品，色谱柱为科瑞Venus-C18-5u，检测器为UVD170U紫外检测器，分析软件为Dionex chromeleox工作站；TGL-16G台式离心机为江苏镇江市科密仪器仪表有限公司产品，KQ-600型超声波清洗器为深圳市艾斯达工业自动化有限公司产品，电子恒温水浴锅为上海普渡生化科技有限公司产品，旋涡混合器为合肥艾本森科学仪器有限公司产品。

1.1.3 DNJ的测定方法 参照Kim等［12］的方法的基本原理，按照Yin等［13］描述的方法测定。

测试样品的提取：称取待测桑叶粉30mg，加入1mL 0.05mol·L-1HCl，涡流1min，超声波处理40min，12 000r·min-1离心30min，收集上清液，沉淀物再按上步重复抽提1次，合并2次上清液，定容至2mL，即得样品提取液。

DNJ的衍生化：取桑叶粉提取液140μL于1.5 mL的离心管，加入0.4mol·L-1硼酸钾缓冲液（pH 值8.5）169μL，再加入5mmol·L-1的衍生化试剂FMOC-Cl（溶解于50%乙腈中）250μL，混匀，25℃恒温水浴中反应20min，加入1mol·L-1甘氨酸（Gly）25μL和剩余的FMOC-Cl以终止反应，再加体积分数为1%的醋酸溶液66μL，用水定容至707μL，最后用孔径0.2μm尼龙膜过滤，收集滤液，即得测试液。

测定方法：采用RP-HPLC法测定，色谱柱为科瑞Venus-C18-5u，检测器为UVD170U紫外检测器，检测波长254nm，流动相为乙腈∶0.1%醋酸（V∶V）＝11∶16，流速为1.0mL·min-1，进样量20μL。分析软件为Dionex chromeleox工作站，外标法分析计算。所有样品均测定3次，平均值为其DNJ含量。

1.2 试验点基本概况 试验于2010年在四川省农业科学院蚕业研究所潆溪科研试验桑园进行，该试验地土壤类型为紫色土。2月测定0～20cm的土壤肥力为：有机质含量3.31%，全氮含量0.16%，有效磷含量11.76mg·kg-1，速效钾含量164.16 mg·kg-1，土壤pH值为7.72。试验桑园栽植桑树品种为川826，树龄6年。桑树栽植株行距0.66m×1.33m，种植密度为11 400株·hm-2，每个小区均设置隔离带。1月上旬修枝整形，每株8根枝条，其他田间管理与常规管理相同。

1.3 试验设计 采用现代肥料二次回归“3414”试验设计，在试验设计中对氮、磷、钾3因素4水平14个处理（表1），随机排列。设计中4个水平的含义：0水平为不施肥，2水平为当地推荐施肥量，1水平＝2水平×0.5，3水平＝2水平×1.5（该水平为过量施肥水平）。每种处理设3个试验小区，小区面积为30m2。在有机肥6 000kg·hm-2的基础上布置各施肥处理，肥料采用尿素（N 46%）、过磷酸钙（P2O512%）、氯化钾 （K2O 60%），在2月下旬施肥。

1.4 调查方法

1.4.1 肥料对桑树不同部位叶DNJ含量的影响2 010年5月20日，查看并标记正常发育、树形较好的桑树。每个小区选择6棵桑树，每棵桑树选择2条典型桑枝。6月10日在相同部位分别采摘2片嫩芽、嫩叶、成熟叶、老叶，每个处理的每个小区的各部位叶分别混合，60℃烘干后，研磨过200目筛，测定各处理桑树不同部位叶的DNJ含量。

表1 “3414”施肥设计方案Tabe 1 Details of“3414”fertilizer experiment design

1.4.2 肥料对桑叶DNJ产量的影响 每个处理实收测产调查，收集每个处理所有的桑叶，60℃烘干后推算每公顷桑树的干桑叶产量。将每个处理烘干的桑叶混合均匀，研磨过200目筛，测定每个处理桑叶的DNJ平均含量。

干桑叶产量（kg·hm-2）＝平均单株干桑叶质量（kg·hm-2）×11 250（株·hm-2）；

桑叶DNJ产量（kg·hm-2）＝桑叶干物质量（kg·hm-2）×桑叶DNJ的平均含量（%）。

1.5 数据分析 采用SPSS 13.0和SAS 9.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 施肥量对桑叶中DNJ含量的影响

2.1.1 施氮量对桑叶中DNJ含量的影响 选取P2K2相同水平不同 N 水平（N0＝0、N1＝120 kg·hm-2、N2＝240kg· hm-2、N3＝360 kg·hm-2），探讨施氮量对桑叶中DNJ含量的影响（图1）。结果表明，在同一处理中春季上位叶DNJ含量明显高于下位叶：嫩芽＞嫩叶＞成熟叶＞老叶；桑叶中DNJ含量随着施氮量的增加而显著增高，在N2水平时，嫩芽、嫩叶、成熟叶和老叶DNJ含量达到最大，分别为0.398 8%、0.349 6%、0.246 2%和0.167 1%，随着施氮量的进一步增加，即N3水平，桑叶中DNJ含量显著降低，但仍显著高于N1水平。

图1 施氮量对桑叶DNJ含量的影响Fig.1 Effects of nitrogen rate on the DNJ content of mulberry leaf

2.1.2 施磷量对桑叶DNJ含量的影响 选取N2K2相同水平不同P水平（P0＝0、P1＝42kg·hm-2、P2＝84kg·hm-2、P3＝126kg·hm-2），探讨施磷量对桑叶中DNJ含量的影响（图2）。结果表明，在同一处理中春季上位叶DNJ含量明显高于下位叶：嫩芽＞嫩叶＞成熟叶＞老叶。嫩芽和嫩叶中DNJ含量变化趋势相同，P2和P3、P0和P1相互之间桑叶中DNJ含量均没有显著差异，但前者DNJ含量显著高于后者，嫩芽和嫩叶中DNJ最高含量分别为0.398 8%和0.349 6%。磷肥对春季成熟叶中DNJ含量影响较大，随着施磷量的增加，成熟叶中DNJ含量也显著增加，在P2水平时达到最大值，为0.246 2%，P3水平时又显著降低，但仍显著高于P1水平。随着施磷量的增加，春季老叶中DNJ含量也显著增加，在P2水平时达到最大值，0.167 1%，P3与P2之间没有显著差异。

2.1.3 施钾量对桑叶中DNJ含量的影响 选取N2P2相同水平不同 K 水平 （K0＝0、K1＝60 kg·hm-2、K2＝ 120kg· hm-2、K3＝ 180 kg·hm-2），探讨施钾量对桑叶中DNJ含量的影响（图3）。结果表明，在同一处理中，春季上位叶中DNJ含量大于下位叶：嫩芽＞嫩叶＞成熟叶＞老叶。嫩芽中DNJ含量在K0、K1和K3水平上均没有显著差异，但均显著低于K2水平的嫩芽中DNJ含量（0.398 8%）；嫩叶、成熟叶和老叶中DNJ含量随着施钾量的增加表现相同的变化：K2和K3、K0和K1相互之间均没有显著变化，但前者显著高于后者，DNJ含量最大值分别为0.349 6%、0.246 2%、0.167 1%。

2.2 桑叶平衡施肥设计肥料效应模型的配置采用SPSS 13.0统计软件，利用当年的肥料和DNJ价格［N（4.1元·kg-1）、P2O5（3.2元·kg-1）、K2O（5.0元·kg-1）、DNJ（2×108元·kg-1）］以及桑叶DNJ产量（表2），建立以桑叶总DNJ产量为函数及氮、磷、钾为因子的肥料效应函数，求算出最佳施肥量及最佳产量。

图2 施磷量对桑叶DNJ含量的影响Fig.2 Effects of phosphorus rate on the DNJ content of mu1berry leaf

图3 施钾量对桑叶DNJ含量的影响Fig.3 Effects of potassium rate on the DNJ content of mu1berry leaf

表2 施肥水平对桑叶DNJ产量的影响Table 2 Effects of fertilazation level on the DNJ content of mulberry

2.2.1 三元二次肥料效应函数 桑叶三元二次肥料效应函数：

由全因子模型求出最佳施肥量及最佳产量，即：桑叶中总DNJ最佳经济产量为23.23kg·hm-2，推荐施肥指标为N 286.11kg·hm-2、P2O 595.22 kg·hm-2、K2O 159.62kg·hm-2。

2.2.2 多种肥料效应函数的施肥决策信息 四川大部分地区都存在过量施肥的情况。本试验对照地参照当地常规施用量施肥，其中N 400kg·hm-2；P2O5200kg·hm-2，K2O 200kg·hm-2，其肥料总投入为3 280.00元·hm-2，DNJ产量为18.59 kg·hm-2；而推荐的施肥方案肥料总投入为2 275.85元·hm-2，肥料投入降低了30.61%，而其DNJ产量为23.23kg·hm-2，增加了24.96%。

3 讨论

氮、磷、钾是植物生长的3种基本要素，但不同的植物对其需要量及其比例是不同的，不同肥力水平的土壤，施用肥料的最佳用量差别很大，尤其是药用植物，对其精准施肥的研究不仅要追求其含量和产量，还要注重次生代谢产物的产量。

张燕等［14］报道，单施氮肥对益母草（Leonurus artemisia）中水苏碱和总生物碱产量有很大的促进作用，足量的磷元素与氮元素合理配施可以提高氮的肥效。纪瑛等［15］研究表明，施用氮肥能显著提高苦参（Sophoraflavescens）中总生物碱的含量和产量，但过量施用则呈降低趋势。陈泉和李建国［16］报道，施肥并不能显著影响植物生物碱的含量，只是显著提高植物干物质产量，从而增加了生物碱产量。其他相关研究［17-19］结果也证明，氮对植物体内生物碱含量具有提高和促进效应。

肥料对桑叶中DNJ的含量和产量的影响的相关研究报道较少。Yin等［10］报道了不同氮素形态及其配比均能显著影响桑叶中DNJ含量。而本研究结果表明，氮、磷、钾单因素均能显著影响春季桑叶中DNJ的含量，不同氮、磷、钾施入量及其配比能显著影响春季桑叶DNJ产量。氮素是DNJ合成的必需元素，所以施氮量对其含量和产量的影响较大，而磷、钾元素可能直接或间接影响DNJ的合成［20］；过量施肥，桑叶DNJ含量不会提高，甚至会显著降低，这可能是破坏了土壤环境的养分平衡或DNJ含量达到一定水平后表现的饱和反应。

本研究利用肥料效应函数得到桑叶DNJ的最佳产量及其最佳施肥指标，为以桑叶为主要原料，并以DNJ为主要成分的产品开发，提供获得高产优质原料的施肥方法，为解决人工栽培中存在的药材质量不稳定等问题提供参考。

植物次生代谢产物的合成过程较为复杂，生物因素和非生物因素均能显著影响其含量［21］，所以对其仍需系统的研究，尤其是影响DNJ生物合成的具体机制需要进一步研究探讨。

4 结论

氮、磷、钾的施肥水平能显著影响桑叶中的DNJ含量。在单因素水平时，随着施肥量的增加，桑叶中DNJ含量也随之显著增加，在N2P2K2水平时达到最大，再增施肥料，其含量基本没有变化或者显著降低，所以科学施肥能显著提高桑叶的DNJ产量。通过建立肥料效应函数，得到桑叶的推荐施肥指标和DNJ最佳经济产量：桑叶中总DNJ最佳经济产量为23.23kg·hm-2，推荐施肥指标为N 286.11kg·hm-2、P2O 595.22kg·hm-2、K2O 159.62kg·hm-2。

［1］Kimura T，Nakagawa K，Kubota H，etal.Food-grade mulberry powder enriched with 1-deoxynojirimycin suppresses the elevation of postprandial blood glucose in humans［J］.Journal Agricultural Food Chemist，2007，55（14）：5869-5874.

［2］Yatsunami K，Ichida M，Onodera S，etal.The relationship between 1-deoxynojirimycin content and alphaglucosidase inhibitory activity in leaves of 276mulberry cultivars（Morusspp.）in Kyoto［J］.Japanese Nature Medicine，2008，62（1）：63-66.

［3］耿鹏，朱元元，杨洋，等.桑树资源中1-脱氧野尻霉素的测定及其生物活性分析［J］.中草药，2005，36（8）：1151-1154.

［4］雷晓燕，黄海华.1-脱氧野尻霉素及其衍生物的药理学与合成研究进展［J］.沈阳药科大学学报，2000，17（6）：456-460.

［5］关丽萍，郑光浩，金晴昊，等.RP-HPLC测定不同地区、不同采集期桑叶中1-脱氧野尻霉素［J］.中草药，2005，36（12）：1881-1882.

［6］李凡，裘雅渔，钱文春，等.桑叶中总生物碱和1-脱氧野尻霉素的含量考察［J］.中国药学杂志，2008，43（3）：176-179.

［7］欧阳臻，陈钧.不同季节桑叶中1-脱氧野尻霉素（DNJ）含量的测定［J］.食品科学，2004，25（10）：211.

［8］施新琴，崔为正，裘立群，等.用反相高效液相色谱—紫外检测法测定1-脱氧野尻霉素的含量［J］.蚕业科学，2006，32（1）：146-149.

［9］Meng X，Ouyang Z，Chang Y，etal.Contrast of 1-deoxynojirimycin content in mulberry leaves from different habitats［J］.Zhong Yao Cai，2008，31（1）：8-10.

［10］Yin H，Tong W H，Ye J J，etal.Effects of nitrogen amount and nitrogen form on 1-deoxynojimycin content in mulberry leaf［J］.Agricultural Science ＆ Technology，2010，11（6）：183-185.

［11］殷浩，佟万红，叶晶晶，等.光照强度对桑叶中1-脱氧野尻霉素含量的影响［J］.安徽农业科学，2010，38（28）：15634-15635，15654.

［12］Kim J W，Kim S U，Lee H S，etal.Determination of 1-deoxynojirimycin inMorusalbaL.leaves by derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate followed by reversed-phase high-performance liquid chromatography［J］.Journal Chromat Ography A，2003，1002：93-99.

［13］Yin H，Shi X Q，Sun B，etal.Accumulation of 1-deoxynojirimycin （1-DNJ）in silkworm，BombyxmoriL.［J］.Journal of Zhejiang Univercity-Science B，2010，11（4）：286-291.

［14］张燕，王文全，杜世雄，等.氮、磷、钾对益母草生长及水苏碱和总生物碱影响的研究［J］.中草药，2007，38（12）：1881-1884.

［15］纪瑛，张庆霞，蔺海明，等.氮肥对苦参生长和生物总碱的效应［J］.草业学报，2008，18（3）：159-164.

［16］陈泉，李建国.栽培因子影响长春花生物碱含量的研究进展［J］.热带农业科学，2009，29（4）：49-54.

［17］Sreevalli Y，Kulkarni R N，Baskaran K，etal.Increaseing the content of leaf and root alkaloids of high alkaloid con-tent mutants of periwinkle through nitrogen fertilization［J］.Industrial Crops and Products，2004，19：191-195.

［18］Afidi M M R K，Afaq Wasiuddiun S H，Khalique A，et al.Effect of different level of nitrogen on growth and alkaloid content ofDaturainnoxiaL［J］.Industrial Journal Pharmacology，1997，6：165-166.

［19］Demeyer K，Dejaegere R.Influence of the ion-balance in the growth medium on the yield and alkaloid con-tent ofDaturastramonium［J］.Plant Soil，1989，114：289-294.

［20］Pan R Z.Plant Physiology［M］.Beijing：Higher Education Publishing House，2004：107-108.

［21］沈晓霞，盛束军，徐建中，等.环境因子对益母草总生物碱含量的影响［J］.浙江农业学报，2002，14（4）：221-225.