用Candida lipolytica脂肪酶手性转酯拆分农药中间体rac-1-苯乙醇

范卫东，范永仙，陈小龙

(1.浙江工业大学 生物与环境工程学院 发酵工程研究所，浙江 杭州 310014;2.浙江天新药业有限公司，浙江 天台 317200)

随着生命科学的进一步发展，人们已充分认识并开始重视手性药物异构体在生物体内代谢、药理作用、临床效果和毒副作用的差异［1］。研究表明，以对映体纯化合物给药比其外消旋物疗效更好、更安全［2］。因此，研究和分离手性化合物具有重要的学术意义和实用价值。光活性醇是精细化学品和药物合成的重要中间体，在农药、医药和化工等领域有着广泛的应用［3］。其制备可以通过化学法或生物法拆分来获得。由于生物法 (生物催化和生物转化)拆分具有高效、反应条件温和、高手性选择性、对环境友好等原因，已引起广泛关注［4-8］。1-苯乙醇是重要的有机化合物，可作为手性中间体被广泛地应用于手性药物或天然产物的合成［9］。由此可见，发展高效的不对称合成方法来合成1-苯乙醇具有十分重要的意义。目前，利用脂肪酶高度的立体选择性，在有机溶剂中进行转酯化手性拆分制备单一手性醇 (酯)倍受人们的关注，特别是手性1-苯乙醇［10-12］。但所用的脂肪酶基本上是Novozym 435(Candida antarctica lipase B，CALB)，而利用其他来源脂肪酶来拆分手性醇比较少。本文比较了CALB和部分其他脂肪酶拆分1-苯乙醇，并使用C．lipolytica脂肪酶手性转酯拆分rac-1-苯乙醇制备 (S)-1-苯乙醇，优化了脂肪酶在有机相中手性拆分1-苯乙醇的条件。

1 材料与方法

1.1 脂肪酶及试剂

C．lipolytica脂肪酶 (北京凯泰新世纪生物技术有限公司)，Novozym 435(Novozymes)，猪胰脂肪酶 (Sigma-Aldrich)，扩展青霉脂肪酶 (福建龙马生化厂)，黑曲霉脂肪酶 (深圳市绿微康生物工程有限公司)，rac-1-苯乙醇和乙酸乙烯酯 (南京康满林化工实业有限公司和江苏永华精细化学品有限公司);所有其他化学试剂均为分析纯。

1.2 转酯化反应

如图1所示，脂肪酶转酯化反应的底物为rac-1-苯乙醇和乙酸乙烯酯，经 C．lipolytica脂肪酶转酯化反应，得到 (S)-1-苯乙醇、 (R)乙酸-1-苯乙酯和乙醛。

具体操作如下:取0.02 mol·L-1(12.2 μL)1-苯乙醇，0.1 mol·L-1(46 μL)乙酸乙烯酯。以乙酸乙烯酯作溶剂，反应体系5 mL，10 mg C．lipolytica脂肪酶，置于30℃，150 r· min-1的摇床中进行转酯化反应。

1.3 产物的分离与检测

图1 脂肪酶转酯化反应

转酯化反应每隔一定时间取样，然后在样品中加入一定比例的乙酸乙酯，振荡萃取30 min，离心(12 000 r·min-1，5 min，4℃)分离，取上层有机溶液，用无水 Na2SO4干燥。产物乙酸-1-苯乙酯和未反应完全的底物1-苯乙醇用SP-6890型气相色谱仪 (山东鲁南瑞虹化工仪器有限公司，装有手性毛 细 管 柱 Cyclodex-B，30 m×0.250 mm ×0.25 mm，FID检测器)分析。色谱条件:柱温使用程序升温，初温85℃维持3 min，升温速率15℃·min-1，终温140℃维持3 min;进样器气化温度和FID检测温度分别为240℃和250℃;载气N2， 流 量 3.0 mL·min-1， 分 流 比 50∶1， 样 量0.4 μL，使用面积归一化法分析。

转化率/%=(初始底物峰面积-剩余底物峰面积)/初始底物峰面积×100。

初始底物峰面积=剩余底物峰面积+生成产物所需的底物的峰面积。

1-苯乙醇对映体过剩值 (e．e．值)/%=(S-1-苯乙醇的峰面积 -R-1-苯乙醇的峰面积)/(S-1-苯乙醇的峰面积 +R-1-苯乙醇的峰面积)×100。

2 结果与分析

2.1 不同来源脂肪酶拆分1-苯乙醇

取 0.02 mol·L-1(12.2 μL)1-苯 乙 醇，0.1 mol·L-1(46 μL)乙酸乙烯酯，乙酸乙烯酯作 溶 剂， 反 应 体 系 5 mL， 摇 床 30℃，150 r·min-1。

由图2可以看出，5种脂肪酶都有拆分能力。Novozym 435可将底物完全拆分，其次是假丝酵母脂肪酶，168 h时底物e．e．值达到19.01%，转化率15.97%。但目前对Novozym 435的研究已经比较成熟，而对假丝酵母脂肪酶的催化拆分条件研究较少，所以本文采用假丝酵母脂肪酶作进一步的研究。

2.2 不同溶剂对反应的影响

图2 不同来源脂肪酶对酯转化的影响

各种溶剂的log P值和对脂肪酶转酯化的影响分别如表1和图3所示。表1和图3可以看出，溶剂的疏水性系数对转化率有一定的影响。除了正己烷以外，疏水性系数大于2.5的溶剂，168 h后转化率均达到30%以上;正庚烷的转化率最高为49.75%，1-苯乙醇e．e．值达到99.02%。故选择正庚烷为溶剂。

表1 有机溶剂的log P

2.3 加酶量对反应的影响

如图4所示，随着加酶量的增加 (5～20 mg)，底物的转化率稳步上升，72 h时转化率从37.40%增加到50.00%，反应速率明显提高。进一步增加酶量，72 h时，30 mg转化率为43.21%，40 mg为48.30%，提高不明显甚至有所下降。所以，从加快反应速率和节约脂肪酶两方面综合考虑，最佳加酶量为20 mg。经过酶量的优化，反应时间从之前的168 h大幅缩短到72 h。

图3 有机溶剂反应的影响

图4 脂肪酶加酶量对转化率的影响

2.4 反应体系水活度对反应的影响

在酶促反应中，水活度对保持酶的活性和酶反应速率非常重要。实验取20 mg C．lipolytica脂肪酶， 0.02 mol·L-1(12.2 μL)1-苯 乙 醇，0.1 mol·L-1(46 μL)乙酸乙烯酯，正庚烷作溶剂，加入不同含结晶水的无机盐来维持水活度摇床温度30℃，转速150 r· min-1(图5-6)。

图5 水活度对转化率的影响

LiCl·H2O(Aw=0.023)水活度过低，脂肪酶失水而失活，转化率只有4.54%;Na4P2O7·7H2O(Aw=0.47)、ZnSO4·7H2O(Aw=0.62)、Na2HPO4·12H2O(Aw=0.85)等水活度过高，影响了酶的均相分布。当水活度为0.35(CuSO4·5H2O)时，转化率最高。

2.5 温度对反应的影响

图6 水活度对1-苯乙醇e．e．值的影响

酶反应温度既影响反应速率，同时也影响酶活性。温度越高，反应速度越快，酶失活越快。实验取 0.02 mol·L-1(12.2 μL)1-苯 乙 醇，0.1 mol·L-1(46 μL) 乙 酸 乙 烯 酯，20 mg C．lipolytica脂肪酶，用正庚烷作溶剂，反应体系5 mL，水活度0.35。

25～45℃时，转化率、1-苯乙醇 e．e．值和反应速率 (图7-8)均随温度升高而上升，96 h转化率从44.73%上升到49.86%，1-苯乙醇 e．e．值从80.93%上升到99.44%，45℃下仅48 h转化率就达到49.84%。当温度继续上升时，转化率和1-苯乙醇e．e．值开始下降，至55℃，96 h时仅剩43.84%。这与文献［11-12］中描述的C．lipolytica脂肪酶在50～60℃失活一致。综合考虑，温度选择45℃较为合适。

图7 温度对转化率的影响

2.6 底物浓度对反应的影响

1-苯 乙 醇 浓 度 分 别 为 0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mol·L-1，乙酸乙烯酯浓度对应为0.1，0.2， 0.3， 0.4， 0.5 mol·L-1时， 放 入45℃，150 r·min-1的摇床中反应。

随着 1-苯乙醇浓度从0.02 mol·L-1上升到0.08 mol·L-1，72 h时的转化率一直维持在49.82% ～49.87%之间，1-苯乙醇 e．e．值也很高，但进一步提高 1-苯乙醇浓度为0.1 mol·L-1时，转化率明显下降至45.82%，1-苯乙醇 e．e．值也只有88.88%。所以0.08 mol·L-11-苯乙醇和0.4 mol·L-1乙酸乙烯酯为较合适的底物浓度 (图9-10)。

图8 温度对1-苯乙醇e．e．值的影响

图9 底物浓度对转化率的影响

图10 底物浓度对1-苯乙醇e．e．值的影响

3 小结

综上可知，利用国产的C．lipolytica脂肪酶手性转酯拆分rac-1-苯乙醇制备 (S)-1-苯乙醇是可行的，较佳反应工艺为:反应体系5 mL，正庚烷为溶剂，加酶量为20 mg，水活度为0.35，反应温度45℃，rac-1-苯乙醇浓度为0.08 mol·L-1，乙酸乙烯酯为0.4 mol·L-1。经过优化，转化率从15.97%上升到49.88%，(S)-1-苯乙醇 e．e．值

由于目前对C．lipolytica脂肪酶手性转酯拆分rac-1-苯乙醇制备 (S)-1-苯乙醇研究比较少，对其酶动力学及动态拆分动力学等还有待进一步研究。

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