牙周膜成纤维细胞与静电纺丝纳米纤维的生物相容性研究

白 轶， 陈 亮， 施 斌

1 武汉大学口腔医学院口腔医院种植科，武汉 430079

2 华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科，武汉 430030

牙周膜成纤维细胞（periodontal ligament fibroblast，PDLF）来源于中胚层，是牙周组织中主要的结缔组织细胞，能够参与牙周组织损伤后的修复，同时，PDLF 也是一种具有多项分化潜能的多能干细胞，具有形成牙骨质、牙槽骨和牙周韧带的能力，是牙周组织修复再生的基础［1］。传统的牙周膜损伤多采用引导组织再生术（GTR）进行修复治疗，虽可取得一定的效果，但由于所采用的聚四氟乙烯（PTFE）膜很难降解吸收，因此需再次手术去除［2］，给患者带来二次手术的风险和痛苦。

随着生物技术和材料科学的发展，以“细胞＋支架”模式为核心的组织工程［3］，为解决这一问题提供了一种新的途径。细胞是种子，是修复组织的主体；支架是载体，为细胞生长提供临时的场所和三维模板。近年来，人工高分子聚合物在组织工程支架中的应用越来越广。其中，聚乳酸［poly（L－lactic acid），PLA］和聚己内酯［poly（ε－caprolactone），PCL］都是经美国FDA 批准的生物医用材料。聚乳酸脆性大，机械性好，生物降解速度快［4］。而聚己内酯韧性强，机械性差，降解速度慢。通过调节两者的合成比例可实现对聚合物性状的调节，以满足特异性组织的生物降解和力学要求。

静电纺丝技术是一种制备高分子聚合物支架的简便方法，该技术的基本原理是聚合物溶液在高压电场中静电雾化，喷射后拉伸成极细的纤维，其制备的支架纤维可达纳米级，可模拟天然细胞外基质结构，是获得纳米级纤维的有效方法［5］。

本实验利用两种材料近似“互补”的特性，按3种比例混合后经静电纺丝技术合成支架，通过研究支架与牙周膜成纤维细胞的生物相容性，筛选最佳的聚合物合成比例，探索其作为牙周膜组织工程支架的可行性。

1 材料与方法

1.1 静电纺丝

静电纺丝纳米纤维支架由华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科提供，简述制备过程如下［6］：聚乳酸（PLA，Mw＝100 000，深圳光华伟业，中国）和聚己内酯（PCL，Mw ＝1 000，Slovery，韩国）按不同质量比（75∶25，50∶50，25∶75）溶于氯仿／甲醇混合液，调整聚合物溶液浓度至10%（质量百分比），磁力搅拌4h至完全溶解。将混合物溶液加至与静电纺丝仪喷丝头（内径0.46 mm）连接的注射器中，电压设为20kV，注射器流量泵速1.0 mL／h，聚合物溶液带电喷射成丝后落在一接地铝箔上，喷丝头与铝箔垂直距离15cm。所得材料置于干燥箱内干燥3d。实验前，揭下铝箔上的薄膜即为纳米纤维支架。上述实验中所用化学试剂均为国产分析纯。

1.2 细胞培养及鉴定

人牙齿拔除后立即置于含1%三抗（青霉素、链霉素、庆大霉素，Sigma－Aldrich，USA）的DMEM（Gibco，USA）培养液中，无菌条件下用无血清DMEM 培养液充分洗涤3次，刮取根中1／3的健康牙周膜，置于含三抗的DMEM 液内，将组织块剪成约1mm×1mm×1mm 大小，移入25mL 培养瓶（Corning，USA）中，倒置培养瓶于5%CO2、37℃培养箱中1h 后，加入含10%胎牛血清（Hyclone，USA）和1%三抗的DMEM 培养液，放入培养箱继续培养。隔日换液，1周后小心去除组织块，用2.5 g／L 胰蛋白酶消化（Invitrogen，USA），用含10%胎牛血清（Hyclone，USA）和1%三抗的DMEM 培养液终止消化并重悬细胞，静置于培养箱培养，至细胞长满瓶底80%时常规传代。

采用波形蛋白免疫荧光法鉴定PDLF。方法如下：取第2代PDLF，胰酶消化后接种到盖玻片上（5×105／mL），在5%CO2、37℃条件下孵育1d。经PBS液漂洗、4%多聚甲醛溶液（Invitrogen，USA）固定、0.1%Triton X－100（Sigma－Aldrich，USA）透化、5%BSA 溶液（Sigma－Aldrich，USA）封闭后，加入兔抗人波形蛋白一抗（Boster，China）工作液并在4℃条件下过夜，次日取出，漂洗后加入羊抗兔Cy3二抗（Beyotime，China）工作液孵育60min，再次漂洗，荧光显微镜（TE2000，Nikon，Japan）下观察。

1.3 细胞接种

3种比例的支架材料分为3 个实验组：75∶25组、50∶50组、25∶75组。支架材料均裁剪成直径5mm 的小圆片，浸入75%乙醇后移入无菌操作台，浸泡1h，使用前PBS漂洗10s×3次，平铺于96孔细胞培养板（Costar，USA）孔底，3种支架各自设5个复孔，在同一行设置无支架的5 个对照孔，实验孔、对照孔均加入胰酶消化后的第3代PDLF 细胞悬液（5×104／mL）200μL。平行试验共制备11块96孔细胞培养板，同时放入5%CO2、37℃细胞培养箱培养。

1.4 形态学观察

接种后1、3、7d，取同一块96孔板，在光学显微镜下观察PDLF 在各比例纳米纤维支架上的形态变化。

1.5 细胞增殖检测

接种后的1～7d，按MTT 细胞增殖及细胞毒性试剂盒说明书（Beyotime，China）操作连续检测，实验孔、对照孔每孔加入10μL MTT 溶液，在培养箱内继续孵育4h。之后每孔加入100μL Formanzan溶解液，再继续孵育4h，酶标仪记录570 nm 波长下的吸光度（A）值。

1.6 细胞粘附检测

接种后12h和24h，各取1块96孔板，将实验孔样品经PBS液漂洗15s后，置于盖玻片上并转入一新6孔板（Costar，USA），加入等量含100ng／mL DAPI的DMEM 培养液（含10%胎牛血清和1%三抗），培养箱中孵育4h，PBS液漂洗15s×6次，盖玻片在荧光显微镜下（TE2000，Nikon，Japan）观察成像，计数细胞数，取平均值。

1.7 细胞活性检测

接种后7d，取一96孔板，将实验孔样品经PBS液漂洗15s后，转移至盖玻片上，用含10μg／mL Hoechst 33342（Beyotime，China）和0.5mg／mL 碘化丙啶（PI，Beyotime，China）的PBS 液孵育30 min，在激光共聚焦显微镜下检测成像。Hoechst 33342显示蓝色标示活细胞，PI显示红色标示死细胞。计数活、死细胞数量（N活、N死），计算活细胞百分率，即P活＝N活／（N活＋N死）×100%。

1.8 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，3 组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）法，两两比较采用配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞培养及鉴定

光镜下，成纤维细胞轮廓清楚，胞体大，形态多样，有纺锤形、多角形或扁平星形，胞核为卵圆形，细胞周围基质分泌旺盛，见图1A。免疫荧光示成纤维细胞胞体高表达波形蛋白，见图1B。

图1 成纤维细胞形态及鉴定Fig.1 The morphology and characterization of PDLF

2.2 形态学观察

随着培养时间的延长，PDLF 在支架上数量逐渐递增。接种后1d细胞经消化后接种到支架上初始时为圆形或卵圆形，3～7d，胞体逐渐展开，粘附于纤维之上，可见50∶50组支架上PDLF数量较其他两种支架多，细胞在支架上分布最密集，75∶25组次之，25∶75组支架上细胞数量最少，见图2。

2.3 细胞增殖

图2 PDLF在不同比例支架上的形态观察Fig.2 Morphology of PDLF on scaffolds with different weight ratios

MTT 法检测结果A 值与细胞数量呈正比。各组细胞增殖曲线趋势基本相同，见图3，1～2d为缓慢增殖期，3～5d为快速增殖期，6～7d为平台期。增殖初期，支架上的PDLF 增殖速度与对照组细胞近似，甚至更快。之后，50∶50组PDLF 增殖快于其他两组和对照组细胞，3实验组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），75∶25组和25∶75组支架组细胞较对照组增殖速度慢，差异有统计学意义（P＜0.05），50∶50组后期细胞增殖速度较对照组慢，但总体比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 细胞粘附

接种12h和24h后，50∶50组支架上粘附的PDLF较75∶25组和25∶75组多，见图4。接种12h后各组粘附细胞数量比较，50∶50组与75∶25组和25∶75 组差异均有统计学意义（均P＜0.05），而75∶25组和25∶75组差异无统计学意义。接种24h后各组间粘附数量分析，两两比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图5。

图3 MTT 法检测细胞增殖Fig.3 Cell proliferation examined by MTT assay

图4 荧光成像示PDLF在不同比例支架上的粘附Fig.4 Attachment of PDLF on scaffolds with different weight ratios by fluorescence imaging

图5 PDLF在不同比例支架上的粘附细胞数比较Fig.5 Comparison of attached PDLF on scaffolds with different weight ratios

2.5 细胞活性

活死细胞染色可在一个图片上同时显示活细胞（蓝色）和死细胞（红色），见图6。根据图片计数不同比例支架上的活死细胞数，得到各自的活细胞比例，代表细胞的活性。50∶50组支架上的活细胞比例（76.5±9.2）%较75∶25组（68.8±10.2）%和25∶75组（53.4±8.4）%多，其红染的死细胞量相对较少。统计分析表明，3组间总体比较差异有统计学意义（P＜0.05），两两比较各组间差异也有统计学意义（均P＜0.05）。

图6 活死细胞染色示PDLF在不同比例支架上的活性Fig.6 Viability of PDLF on scaffolds with different weight ratios by Live／Dead staining

3 讨论

已有研究表明，静电纺丝聚乳酸／聚己内酯纳米纤维具有很好的细胞相容性［3，7－8］，但其与牙周膜成纤维细胞的相容性尚缺乏文献报道。这种纤维具有纳米级的纤维直径和孔隙，可为细胞增殖、粘附提供充足的空间和营养、信号交换。随着2种聚合物的合成比例的变化，纤维的三维结构必然发生改变［9］，这种改变是否适合细胞生长，是本实验需要解决的问题之一。同时，通过研究各种比例支架对细胞生长的影响，探索出聚合物纳米支架最佳的合成比例。

在增殖检测中，实验组和对照组细胞均显示出相似的增殖曲线，说明PDLF 能够在各种比例的支架上生长。在接种后的1～2d，支架上PDLF 数量甚至超过常规培养的细胞，这可能是由于纳米纤维支架提供了更大的表面积和三维空间，使更多的细胞得以粘附。随着时间的推进，75∶25支架和25∶75支架的细胞增殖速度明显逊于对照组，这可能是由于材料的降解，聚合物降解后CO2的堆积致使细胞外液酸性增大，限制了细胞的生长。50∶50支架在接种3～5d后增殖速度一度超过对照组，说明其受影响较小，但最终还是不及常规培养下的细胞。但这表明50∶50支架组是最接近PDLF 生理条件下细胞外基质的。

本研究通过细胞计数直接比较各组间细胞的粘附能力。结果表明50∶50支架上的PDLF 粘附数量多于其他两种比例的支架，最接近正常培养状态下的细胞粘附率。

活死细胞染色是一种直观地反映细胞活性的方法。在共聚焦显微镜下，50∶50支架上的PDLF 相对活性好，活细胞百分率高于其他两组，提示50∶50支架对细胞活性的影响最小，所提供的细胞外环境最接近正常生理条件。

综上所述，50∶50 支架组生物相容性最优，说明50∶50是此复合支架中聚乳酸和聚己内酯最佳的合成比例。同时，PDLF 能够在静电纺丝纳米纤维上生长、增殖、粘附，并具有正常的细胞活性，此支架可作为牙周膜组织工程候选支架材料。

［1］ Nagatomo K，Komaki M，Sekiya I，et al.Stem cell properties of human periodontal ligament cells［J］.J Periodontal Res，2006，41（4）：303－310.

［2］ El－Awady A R，Messer R L，Gamal A Y，et al.Periodontal ligament fibroblasts sustain destructive immune modulators of chronic periodontitis［J］.J Periodontol，2010，81（9）：1324－1335.

［3］ Gimble J M，Katz A J，Bunnell B A.Adipose－derived stem cells for regenerative medicine［J］.Circ Res，2007，100（9）：1249－1260.

［4］ Wu D，Zhang Y，Zhang M，et al.Selective localization of multiwalled carbon nanotubes in poly（epsilon－caprolactone）／polylactide blend［J］.Biomacromolecules，2009，10（2）：417－424.

［5］ Baji A，Mai Y W，Wong S C，et al.Electrospinning of polymer nanofibers：Effects on oriented morphology，structures and tensile properties［J］.Compo Sci Technol，2010，70（5）：703－718.

［6］ Liao G Y，Chen L，Zeng X Y，et al.Electrospun poly（L－lactide）／poly（ε－caprolactone）blend fibers and their cellular response to adipose－derived stem cells［J］.J Appl Polym Sci，2011，120（4）：2154－2165.

［7］ 陈亮，彭鄂军，吴柏霖，等.静电纺丝聚乳酸／聚己内酯共混纤维支架与兔脂肪源干细胞的体外生物相容性研究［J］.华中科技大学学报：医学版，2011，40（5）：513－516.

［8］ Gunn J，Zhang M.Polyblend nanofibers for biomedical applications：perspectives and challenges［J］.Trends Biotechnol，2010，28（4）：189－197.

［9］ Lopez－Rodriguez N，Lopez－Arraiza A，Meaurio E，et al.Crystallization，morphology，and mechanical behavior of polylactide／poly（ε－caprolactone）blends［J］.Polym Eng Sci，2006，46（9）：1299－1308.