截短人胱硫醚β－合成酶的可溶性表达、纯化及活性鉴定＊

王利群， 顾雅平， 曹利民，， 汪 庆， 于海燕， 奚学志， 孙培培， 沈关心

1常州大学制药与生命科学学院，常州 213164

2常州二十一世纪生物技术研究所有限公司，常州 213164

3华中科技大学同济医学院基础医学院免疫学系，武汉 430030

2 Changzhou 21st Century Biotech Research Institute，Changzhou 213164，China

胱硫醚β－合成酶（cystathionineβ－synthase，CBS），又名L－丝氨酸水解酶（L－Serine hydrolyase），参与同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）的代谢，催化5′－磷酸吡哆醛（pyridoxal－5′－phosphate，PLP）依赖的β－取代反应，是转硫作用的关键酶。研究发现，哺乳动物CBS 是唯一已知的PLP 依赖型血红素蛋白［1－3］。该酶的缺失突变可引起CBS酶活性下降，将导致血浆中Hcy浓度升高，可能引发高同型半胱氨酸血症及其他如心血管疾病、糖尿病、动脉粥样硬化等多种并发症。研究证实，血浆中高浓度的Hcy已成为栓塞、心血管疾病的一个独立危险因素。因此，Hcy的检测已成为研究新热点。而用于Hcy检测的关键酶CBS目前多为进口产品。所以实现可溶性高酶活性的CBS蛋白的国产化显得尤为重要。

全长人胱硫醚β－合成酶（hCBS）是一个由分子量为63kD 的亚基（551个氨基酸）构成的同源四聚体，包含一个血红素结合结构域（N 端70个氨基酸残基）、一个高度保守的催化结构域（PLP结合结构域，第40～413 位氨基酸残基）和一个调节结构域（C端140个氨基酸残基）［4］。调节结构域包含一个S－腺苷蛋氨酸（S－adenosylmethionine，AdoMet）结合位点，对酶的活性有调节作用，是CBS的变构激活剂。去除C 端调节结构域的截短人胱硫醚β－合成酶（T－hCBS），为同源二聚体结构，不响应变构激活剂AdoMet，可增加酶的比活力，改变酶的稳态动力学参数［2，5－9］。

本研究仅表达全长人胱硫醚β－合成酶的前413个氨基酸序列，构建表达载体pET－15b／T－hCBS，利用大肠埃希菌BL21表达T－hCBS，通过表达条件的优化得到高产可溶性蛋白，并对重组蛋白T－hCBS活性进行了检测，为Hcy检测试剂盒的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

DL－同型半胱氨酸（DL－homocysteine，DLHcy）、L－胱硫醚（L－cystathionine，L－Cth）、PLP、茚三酮为Sigma 公司产品；L－丝氨酸（L－serine，LSer）、异丙基－β－半乳糖苷（isopropyl－β－D－thiogalactopyranoside，IPTG）、牛血清白蛋白标准品、考马斯亮蓝R－250、蛋白胨、酵母粉、丙烯酰胺等为上海捷瑞生物技术有限公司产品；pET15b 载体为Novagen公司产品；Ni2＋亲和柱、HiTrap 脱盐柱为GE Healthcare公司产品；氨基酮戊酸（δ－aminolevulinic acid，δ－ALA）为化工中间体；其他试剂为分析纯产品。

1.2 T－hCBS重组蛋白表达载体的构建

根据NCBI网站公布的hCBS 的基因序列，经序列优化后由上海捷瑞生物技术有限公司合成目的基因序列，构建表达载体pET－15b／T－hCBS。

1.3 T－hCBS重组蛋白的表达及条件优化

1.3.1 T－hCBS重组蛋白的表达 将成功构建的pET－15b／T－hCBS质粒转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞，挑取单克隆，接种入5mL含氨苄青霉素（100μg／mL）的LB 培养液中，37℃、220r／min 振荡培养过夜。次日将过夜培养菌液以1∶100比例加入50mL含氨苄青霉素（100μg／mL）的LB培养液中，37℃振荡培养至A600nm为0.6～0.8，加入诱导剂IPTG。在不同温度下诱导培养，诱导结束后离心收集菌体。菌体用20 mmol／L 磷酸盐缓冲液（phosphate buffer，PB，2.6 mmol／L NaH2PO4，17.4mmol／L Na2HPO4，pH7.6）洗1次，－40℃冻融2次。再以20 mmol／L PB 悬浮菌体（每克菌体以10mL PB 悬浮），悬浮液中加20μmol／L PLP，180Hz超声破碎细菌（超声2s，间歇5s，超声时将菌体悬浮液置于冰水浴中散热），至菌体清亮。4℃、10 000r／min 离心40 min，收集上清，15% SDSPAGE检验重组T－hCBS的可溶性表达。

1.3.2 T－hCBS重组蛋白表达条件的优化 ①最佳IPTG 诱导浓度的确定：改变诱导剂IPTG 的终浓度，分别为0.1、0.2、0.5、1.0 mmol／L。37℃、220r／min诱导4h。15%SDS－PAGE检验重组ThCBS的可溶性表达情况。②最佳诱导温度的确定：在最佳IPTG 浓度下，改变诱导温度，分别设为20、25、30、37℃。15%SDS－PAGE 检测表达情况。③最佳诱导时间的确定：在最佳IPTG 浓度及最佳诱导温度下，改变诱导时间，分别为5、10、15、20、25 h。15% SDS－PAGE 检测表达情况。④最佳δ－ALA 浓度的确定：在优化的诱导表达条件基础上，LB培养液中添加不同浓度的δ－ALA，分别为25、50、75、100 mg／L。15% SDS－PAGE 检测表达情况。

1.4 T－hCBS重组蛋白表达产物的纯化

1.4.1 T－hCBS重组蛋白的大量表达 从LB 平板上挑取单克隆，接种入5mL 含氨苄青霉素（100 μg／mL）的LB培养液中，37℃、220r／min振荡培养过夜。次日将5mL 过夜培养菌液加入500mL 含氨苄青霉素（100μg／mL）和δ－ALA（100mg／L）的LB培养液中，37℃振荡培养至A600nm为0.6～0.8，加IPTG 至终浓度0.1mmol／L，20℃、220r／min诱导5h，离心收集菌体。菌体用PB 洗1次，－40℃冻融2次。每克菌体用10mL PB 悬浮菌体，悬浮液中加20μmol／L PLP，180 Hz超声破碎细菌，至菌体清亮。4℃、10 000r／min离心40min，收集上清，15%SDS－PAGE检验重组T－hCBS在上清中的表达。

1.4.2 T－hCBS重组蛋白表达产物的纯化 上述上清液用Ni2＋亲和层析柱，按照GE Healthcare公司提供的纯化手册纯化重组蛋白T－hCBS。①纯化前样品处理：超声破碎离心后获得的上清，加一定体积的NaCl溶液，使终浓度为0.5mol／L（与结合缓冲液及洗脱缓冲液中的NaCl终浓度一致），加咪唑使其终浓度为20mmol／L（与结合缓冲液中咪唑终浓度一致），调节pH 值至7.4左右，再经0.22μm的滤膜过滤。②Ni2＋亲和柱的准备：用10个柱体积的双蒸水洗柱，再用5个柱体积的结合缓冲液平衡Ni2＋亲和层析柱。③样品上柱：经滤膜过滤后的上清液缓慢上柱，使蛋白上的His标签与Ni2＋亲和层析柱充分结合，用15个柱体积的结合缓冲液洗柱。起始洗柱速度尽量慢些，防止目的蛋白被洗去，之后可逐渐加快洗柱速度。④蛋白洗脱：用5个柱体积的洗脱缓冲液（含0.5mol／L 咪唑）进行洗脱，收集目的蛋白（1 mL／管），每管取5 μL 用15% SDSPAGE检测。⑤柱子的清洗及储存：用5个柱体积的结合缓冲液洗柱，再用15 个柱体积的双蒸水洗柱，再20%乙醇洗柱后于4℃保存。⑥浓缩：将收集的蛋白合并后转移至透析袋，覆盖适量蔗糖，加少量水后4℃透析过夜。⑦纯化蛋白脱盐：在Bio－Rad中高压层析仪用HiTrap Desalting column进行脱盐，具体操作参照仪器说明书，脱盐后的重组融合蛋白被转移至新的缓冲液PBS中。

1.5 纯化产物的活性检测

参照Kashiwamata、Seman等［10－11］提出的茚三酮显色法稍作改进。取10μL 1mol／L L－Ser，2.4 μL 10mmol／L PLP以及5μg T－hCBS加至反应缓冲液（100 mmol／L Tris－HCl，pH 8.6）。37℃预孵育10min后，加入DL－Hcy至终浓度75mmol／L，反应混合液终体积200μL。于37℃孵育60 min后，加入20μL 50%三氯乙酸终止反应，混匀后于5 000r／min离心5min。取上清100μL，加入1.65 mL 茚三酮试剂（1g茚三酮溶于100mL冰醋酸后，加1／3体积磷酸）。混匀后，沸水浴10 min，冰浴5 min。室温静置20min，用分光光度计测定455nm波长处的吸光度。同时设定空白对照，即以高温失活的酶取代测定组中所用的高活性酶，其他操作步骤如上述。酶活性计算公式：胱硫醚（μmol）＝［（S－B）／A］×Ⅱ；式中S：测定组吸光度值，B：空白对照组吸光度值，A：1μmol胱硫醚的吸光度值，Ⅱ：2.2。

一个酶活力单位定义为在上述反应条件下，37℃每小时催化生成1μmol胱硫醚所需的酶量。

胱硫醚标准曲线的建立：配制不同浓度的胱硫醚溶液，各取90.9μL，加50%三氯乙酸9.1μL，使总体积为100μL，胱硫醚含量分别为0、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5μmol。加入1.65mL 茚三酮试剂，混匀后，沸水浴10min，冰浴5min。室温静置20min，用分光光度计测定455nm 波长处的吸光度。

2 结果

2.1 T－hCBS重组蛋白表达载体的构建

根据hCBS的基因序列，去除C端调节结构域，在N 端加入6个His tag，经基因优化后，通过全基因合成法合成目的基因片段，构建表达载体pET－15b／T－hCBS。测序结果得到与预期一致的ThCBS序列。重组蛋白T－hCBS的氨基酸序列见图1。

图1 重组蛋白T－hCBS的氨基酸序列Fig.1 The amino acid sequence of recombinant protein T－hCBS

2.2 T－hCBS重组蛋白表达条件的优化

将构建成功的载体pET－15b／T－hCBS 转化表达菌E.coli BL21（DE3）感受态细胞，经1mmol／L IPTG，37℃诱导4h 后，15%SDS－PAGE 于相对分子质量约45kD 处可见特异表达带，与预期大小相同。该表达条件下获得的目的蛋白主要以包涵体形式表达，上清中所占比例很小（图2）。经IPTG 浓度、诱导温度、诱导时间、δ－ALA 浓度等条件优化后（图3），获得的最佳表达条件：100mg／Lδ－ALA 浓度培养，0.1mmol／L IPTG，20℃诱导5h。可溶性分析显示此优化后蛋白以可溶体形式表达，可溶性蛋白占总蛋白量近一半（图2）。

图2 重组蛋白T－hCBS的表达Fig.2 Expression of recombinant protein T－hCBS

图3 重组蛋白T－hCBS表达条件的优化Fig.3 The optimization of the recombinant protein T－hCBS expression conditions

2.3 T－hCBS重组蛋白的纯化

构建表达载体时在目的蛋白N端带有6个组氨酸标签（6－His tag），可用Ni2＋亲和层析柱纯化重组蛋白，操作简单、快速，且纯化后蛋白无需去除6－His tag［12－13］。蛋白表达量可达44 mg／L，蛋白回收率达80%以上（表1），经15%SDS－PAGE检测，表明目的蛋白得到纯化（图4）。该蛋白的表达菌体、超声后上清及纯化的蛋白溶液均呈现明显红色，说明该蛋白血红素饱和度较高，表达产物具有明确的活性。其中，培养过程中未添加δ－ALA 的1mg／mL T－hCBS蛋白颜色呈淡黄色，而加入δ－ALA培养后，纯化后的1mg／mL ThCBS蛋白呈明显的红棕色（图5）。由此可见，在菌液扩大培养过程中，δ－ALA的加入，对目的蛋白活性及血红素含量的提高起着关键性的作用。

图4 重组蛋白T－hCBS的纯化Fig.4 Purification of recombinant protein T－hCBS

图5 纯化T－hCBS蛋白溶液示意图Fig.5 The diagram of purified T－hCBS solution

2.4 纯化蛋白的活性检测

胱硫醚经茚三酮显色后的全波长扫描图（图6），在455nm 处有一最大吸收峰，与文献报道相符［10］。且酶促反应产物在不同波长下的扫描图与胱硫醚标准品的吸收光谱曲线图有很好的一致性，两者相关性良好。故在455nm 波长下所测得的吸光度值可表示酶促反应体系中胱硫醚的生成量。经活性检测，500mL菌液经纯化后获得的T－hCBS蛋白比活约为1 100U／mg，总活力在25kU 以上（表1）。

图6 标准品胱硫醚和酶促反应产物经茚三酮显色后的吸收光谱Fig.6 Absorption spectra of colored ninhydrin reaction product of authentic cystathionine and of the enzyme reaction product in acid medium

表1 大肠埃希菌原核表达T－hCBS的纯化Table 1 Purification of human cystathionineβ－synthase expressed in E.coli

3 讨论

自McCully［14］于1969 年提出血液中高浓度Hcy与动脉粥样硬化有关的观点以来，国内外学者围绕这一问题展开了大量的研究。近年来研究确认，高同型半胱氨酸血症与动脉粥样硬化、高血压、心肌梗死等多种心血管疾病的发生有密切的联系，是心血管疾病的一个独立危险因素。血浆中Hcy浓度每减少3μmol／L，缺血性心脏病发生率减少11%，卒中发生率减少19%［15］。Hcy在临床上可作为心血管疾病，尤其是冠状动脉粥样硬化症和心肌梗死的重要危险指标，其浓度的升高程度与疾病的危险性成正比。目前，在欧美国家，Hcy已成为常规检测项目。由此可见，对CBS进行研究开发有着深远的意义，具有广泛的应用前景。

另外，hCBS在高同型半胱氨酸血症的治疗上也有一定的应用价值。目前对该病症的治疗措施仅是普遍采用外源性给予辅酶VitB6、VitB12和叶酸等传统方法，临床效果多不理想。而hCBS在Hcy的代谢过程中，能转化体内46%的Hcy，其转硫作用是去除过量含硫氨基酸的主要途径。若能在纯化的rhCBS中加入药用辅料，制成治疗高同型半胱氨酸血症尤其是对VitB6、VitB12和叶酸不敏感患者的高效药物，将会具有良好的应用前景。而目前国内仅见1 篇专利文献报道CBS 的药用应用性研究［16］。

本研究通过全基因合成法合成已知序列的目的基因片段，相比利用PCR 技术从cDNA 文库中获取目的基因的方法，该法高效快捷，且可避免基因突变的风险。全长hCBS为同源四聚体蛋白，可与变构激活剂AdoMet结合，使自我抑制区从催化部位发生位移导致构象改变，活性提高3～8倍；去除C端调节结构域的T－hCBS（1－413），不响应AdoMet的激活，但并不影响与血红素的结合。截短酶的二聚体晶体结构显示，其血红素结合位点暴露于蛋白表面［2，5］。T－hCBS的活性可与通过AdoMet激活的全长hCBS 活性相媲美［17］。本研究构建原核表达载体pET15b／T－hCBS，在目的蛋白的N 端插入6个His tag，便于后续的分离纯化。

通过优化原核表达系统得到可溶性表达的重组蛋白T－hCBS，可溶性蛋白与包涵体蛋白各占一半，蛋白分子量为45kD 左右。IPTG 浓度、诱导时间和诱导温度对目的蛋白表达的实验结果显示，温度是重要的影响因素，在可溶性表达中起着关键作用。δ－ALA 为血红素前体，加入后可增加hCBS的产量及血红素饱和度［18］。随着培养过程中δ－ALA 量的加大，上清中的目的蛋白hCBS表达量亦增加。虽然，目前还不清楚血红素在CBS中的具体功能，但它可调节hCBS活性［19］，是保证hCBS活性的必需因素。在扩大培养过程中加入δ－ALA，与不加δ－ALA 相比，菌体及纯化后蛋白呈现明显红色，一定程度上表明其血红素含量增加，活性增高。经茚三酮法测定T－hCBS活性，比活约1 100U／mg，远高于采用生化法从人肝中纯化的CBS比活力160U／mg［20］以及王伟等［21］通过原核表达获得的纯化全长CBS比活力57 U／mg。该蛋白经纯化脱盐后产量可达44mg／L，高于王伟等［21］的表达量19mg／L及Frank和Majtan等［9，17］的表达量10～19mg／L。

本文主要介绍了T－hCBS 的原核表达纯化过程，通过对表达条件的优化，成功表达出带有6－His tag的高产高酶活性的可溶性重组蛋白T－hCBS。适用于工业化大生产，对下游Hcy快速检测试剂盒的开发或研制治疗高同型半胱氨酸血症的药物具有一定的潜在应用价值。

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