经导管移植自体骨髓间充质干细胞对猪急性心肌梗死后心功能的影响＊

孙海燕， 王显良， 何 飞， 武惠敏， 刘迎春， 杨秀丽， 李 波， 赵国安△

1 新乡医学院第三附属医院心内科，新乡 453003

2 厦门市第二医院重症监护室，厦门 361021

3 新乡医学院第一附属医院血液透析室，卫辉 453100

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是临床上一种严重的缺血性心脏病（ischemic heart disease，IHD）。有功能心肌细胞数量的减少及继发心肌重塑是心肌梗死后心力衰竭的主要原因。如何增加有功能心肌细胞的数量是目前心血管领域研究的热点，而自体骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因其诸多优势成为治疗心肌梗死的热点细胞。本实验通过制备猪急性心肌梗死模型，将自体MSCs经导管注入至梗死区域相关冠状动脉，检测心肌梗死前后心功能变化并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂

巴马香猪13 头，雌雄不限（河南省农科院提供），3～4月龄，体重18～25kg。随机分为对照组和MSCs移植组。

VEGF ELISA 试剂盒、CD34、CD105（R＆D 公司）；Ⅷ因子兔抗人一抗、羊抗兔二抗、DAB 免疫组化显色试剂盒（北京中山金桥生物技术公司）；特级胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）。

1.2 自体MSCs的体外培养和鉴定

巴马香猪肌注麻醉（氯胺酮15 mg／kg）后仰卧位固定，抽取骨髓20mL，采用Percoll液密度梯度分离［1－3］联合贴壁培养法进行细胞培养，用免疫荧光法检测第3 代细胞表面抗原CD34、CD105，鉴定MSCs。

1.3 心肌梗死模型的建立

猪用氯胺酮麻醉后固定于操作台上，消毒、铺巾，Seldinger法穿刺右股动脉，置入6F 鞘管，经鞘管给予肝素200 U／kg，6FJL4指引导管行左冠脉造影，BMW Universal指引导丝至冠状动脉左前降支（left anterior descending coronary artery，LAD）远端，2.0mm×15mm OTW 球囊送至前降支第2对角支以远，4atm 扩张球囊，连续4 次，时间分别为30、60、120、300s，每次间隔30s，最后封堵前降支。造影显示球囊远端血流完全中断，持续30 min。记录心电图，并留取静脉血行肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK－MB）检查。

1.4 MSCs的移植

心肌梗死模型建立后即刻取经4，6－二咪基－4－联苯基吲哚（4，6－Diamidino－2－Phenylindole，DAPI）标记的第3代MSCs悬液2mL，经OTW 球囊注入移植组前降支，保留球囊2 min。对照组同法注入等体积的无血清DEME 培养液。术后继续常规喂养4周。

1.5 心功能测定

对所有实验动物于制模前、制模后4周行超声心动图检查测量左室收缩末期内径（left ventricular end－systolic dimension，LVESD）、左室舒张末期内径 （left ventricular end－diastolic dimension，LVEDD）和左室射血分数（left ventricle ejection fraction，LVEF），测量3次取平均值。

1.6 心肌组织学及免疫组化检测

1.6.1 心肌组织学检查 移植4周后处死动物，立即取心脏，冷PBS冲洗后称重，剪去左、右心房，右心室及脂肪组织，将左心室沿长轴切成小块，制成冰冻切片，采用2，3，4－三苯基氯化四氮唑（TTC）染色，用计算机图像分析系统测量每片心室肌面积和梗死心肌面积。

1.6.2 血清VEGF 浓度检测 在制模前、移植后即刻、移植后5、7、10d及4周时抽取全血，离心后取血清1.0 mL 用ELISA 试剂盒检测血清中VEGF的浓度［4］。

1.6.3 毛细血管计数 组织切片经Ⅷ因子标记染色，把染色阳性的内皮细胞作为毛细血管计数。每只动物随机选取3张切片，每张切片选取5个放大400倍视野进行观察，计数毛细血管数目。

1.7 统计学方法

应用SPSS 12.0统计软件包进行数据处理，计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MSCs的形态学变化及鉴定

原代细胞在光镜下呈圆形或类圆形，大小不一，数目较多。多次换液后，细胞呈纺锤形或多边形，部分可见双核仁（图1A）。7d后，细胞铺满瓶底，大部分细胞变为长梭形，少部分呈多角形，细胞呈旋涡状排列（图1B）。传代后镜下细胞分散均匀、辐射状平行排列，呈均一纺锤形，似成纤维细胞样。细胞经免疫荧光检查，细胞表面未见红色荧光，提示CD34阴性（图2A），但可以见到绿色荧光，提示CD105阳性（图2B）。

2.2 心肌梗死模型制备前后心肌酶学的变化

13只猪接受心肌梗死模型制备，其中3只因室颤死亡。制模前、制模后6h两组间心肌酶学（CK、CK－MB）比较差异均无统计学意义。与制模前心肌酶学相比，制模后6h两组血清CK、CK－BM 均较制模前明显升高（P＜0.05，P＜0.01），见表1。

图1 原代培养细胞（×200）Fig.1 Primary cell culture（×200）

图2 细胞免疫荧光检查（×400）Fig.2 Detection of immunofluorescence（×400）

表1 两组动物不同时间心肌酶的比较（±s，n＝5，U／L）Table 1 Cardiac enzymes of the two groups at different time points（±s，n＝5，U／L）

表1 两组动物不同时间心肌酶的比较（±s，n＝5，U／L）Table 1 Cardiac enzymes of the two groups at different time points（±s，n＝5，U／L）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs.before operation

Before op eration 6hafter op eration Groups CK CK－MB MSCs 631.80±28.44 9.51±0.36 1 943.50±112.40＊620.40±11.20 CK CK－MB＊＊Control 618.50±30.12 9.45±0.33 2 023.10±127.45＊613.50±10.30＊＊

2.3 两组左室内径及心功能的变化

较制模前，MSCs移植后4周两组LVEF 均明显降低，LVEDD 和LVESD 均显著增加（均P＜0.05）。MSCS移植组与对照组比较LVEF 显著增加，LVEDD 和LVESD 均显著减少（均P＜0.05），见表2。

表2 移植前后超声心动图检测结果（±s，n＝5）Table 2 Echocardiography before and after MSCs transplantation（±s，n＝5）

表2 移植前后超声心动图检测结果（±s，n＝5）Table 2 Echocardiography before and after MSCs transplantation（±s，n＝5）

＊P＜0.05 vs.before operation；▲P＜0.05 vs.control group

Control group MSCs group Parameters lantation LVEF（%）56.76±1.13 34.54±1.55＊57.46±2.02 40.96±0.78 Before operation 4weeks after transp lantation Before operation 4weeks after transp＊▲LVESD（mm）23.54±1.03 34.68±0.53＊22.81±1.28 29.28±1.61＊▲LVEDD（mm）35.16±1.34 48.78±1.89＊34.08±2.30 41.66±1.53＊▲

2.4 两组心肌梗死面积的比较

移植后4 周，MSCs 移植组心肌梗死面积为（18.0±5.8）%，对照组的心肌梗死面积为（23.0±7.2）%，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.5 两组不同时间点血清VEGF含量的变化

术前两组动物的血清VEGF 含量差异无统计学意义，术后开始升高，对照组术后第5天达高峰，而MSCs移植组从术后第5 天起VEGF 含量较对照组增加，术后第7～10天达高峰，术后4周仍高于对照组（P＜0.05），见表3。

表3 不同时间点两组动物血清VEGF含量（±s，n＝5，pg／mL）Table 3 Serum VEGF levels of the two groups at different time points（±s，n＝5，pg／mL）

表3 不同时间点两组动物血清VEGF含量（±s，n＝5，pg／mL）Table 3 Serum VEGF levels of the two groups at different time points（±s，n＝5，pg／mL）

＊P＜0.05 vs.control group

Time points Control group MSCs group Before operation 508.20±9.73 509.60±16.27 After operation 585.60±6.43 592.80±11.19 5th day 715.60±8.65 907.20±26.25＊7th day 618.40±9.34 1246.00±62.29＊10th day 537.60±15.95 954.40±17.63＊4th week 505.40±11.22 595.60±30.44＊

2.6 两组Ⅷ因子免疫组化染色及毛细血管密度的比较

在MSCs移植组梗死周边区及梗死区可见血管内皮细胞呈棕色的阳性血管，在对照组中上述区域同样可以观察到有新生血管（图3），但血管密度低于移植组［（50.5±3.8）／mm2vs.（103.6±4.4）／mm2，P＜0.05］。

图3 移植后4周心肌Ⅷ因子免疫组化染色及毛细血管计数（×400）Fig.3 Vessels counted by immunohistochemistry with factor Ⅷmonoclonal antibody at 4th week after transplantation（×400）

3 讨论

研究表明，在缺血性心脏病引起的心力衰竭患者中，心肌的血液灌注及心肌细胞数量减少是影响心肌梗死后心脏功能的关键性因素［5－6］，故改善受损区域的血供，挽救功能受抑的心肌细胞，增加心肌细胞数量可恢复梗死后心脏功能。本实验评价了两组实验动物心肌梗死区及梗死周边毛细血管密度的差别，观察到细胞移植组的血管较对照组增加，且部分微血管的管腔内可见到有红细胞存在，提示这些血管可能参与冠状动脉微循环的心肌灌注，从而改善心肌的血液灌注。VEGF是一种内皮细胞的特异性有丝分裂原及肝素结合分子，作用于血管内皮细胞，在体外可促进内皮细胞生长，在体内可诱导血管发生，激发Ⅶ因子的释放，改变细胞外基质使其更易于血管生长，是促使血管生成的关键因子之一。本实验对VEGF水平进行检测，结果提示细胞移植组血清VEGF 水平明显高于对照组。VEGF 还可以通过介导蛋白激酶B 磷酸化和内皮一氧化氮合酶的合成延长内皮细胞的寿命，提高缺血组织的局部血流。VEGF同样能抑制肿瘤坏死因子α、H2O2和缺氧等多种因素诱导的血管内皮细胞的凋亡［7］。既往研究［8］证明干细胞在体外培养过程中及移植后具有分泌作用，可分泌与细胞生长有关的细胞因子，但对照组同样存在VEGF，可能心肌梗死后炎症同样会刺激细胞分泌细胞因子。另外，Barry 等［9］用SH－2从人MSCs 中分离出相对分子量为92kD 的蛋白质，经纯化分析证明该蛋白质为Endeglin（CD 105）。越来越多的证据表明CD105在血管生成中有重要作用，因此将CD105作为新生血管形成的标记［10］。本实验MSCs鉴定证明MSCs CD105阳性，推测MSCs可以分化为血管内皮细胞，促进血管新生，改善心肌血液供应。

总之，急性心肌梗死后移植MSCs可能分泌一系列细胞因子，诱导血管新生，还可能分化为血管内皮细胞，改善缺血区和梗死区血流灌注，改善心脏功能。

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