PHI对前列腺癌PC3细胞组蛋白甲基化及乙酰化的调控＊

庄志明， 黄轶群， 马旭东， 郑亚才， 郑周达

福建医科大学附属漳州市医院泌尿外科，漳州 363000

雄激素非依赖性是目前制约晚期前列腺癌疗效的主要原因，开发新的抗癌药物是中晚期前列腺癌治疗的迫切要求。异硫氰酸以硫配糖体形式广泛存在于各种十字花科如茎椰菜、甘蓝和水田芥等植物中［1］。异硫氰酸苯己酯（phenylhexyl isothiocyanate，PHI）已被人工合成。动物实验表明，PHI对多种肿瘤具有广泛有效的抑制作用。Srivastava等［2］报道，异硫氰酸丙烯酯（AITC）对移植于裸鼠的人类前列腺癌细胞（PC3）的增殖有明显抑制作用，而对正常的前列腺上皮细胞生长无毒副作用。我们前期的研究［3－5］也发现，PHI可抑制白血病细胞组蛋白去乙酰化酶，上调组蛋白乙酰化酶P300，调控组蛋白乙酰化及甲基化。本研究旨在探讨PHI对前列腺癌PC3细胞的作用，检测PHI对前列腺癌细胞凋亡相关蛋白、组蛋白乙酰化、甲基化的影响，阐述PHI诱导雄激素非依赖性的前列腺癌细胞凋亡的分子机制。

1 材料与方法

1.1 试剂

异硫氰酸苯己酯（PHI）购自美国LKT Laboratories公司，以75%甲醇配成5 mmoL／L 存储液，0.22μmol／L 微孔滤膜正压过滤后－20℃保存。

一抗：Bcl－2，Caspase－9、Caspase－3、Mcl－1、Cyt－C、XIAP购自Santa Cruz公司；Anti－acetyl－Histone H3、Anti－acetyl－Histone H4、Anti－monomethyl－Histone H3（Lys4）、Anti－monomethyl－Histone H3（Lys9）购自Upstate公司（美国）。二抗：羊抗兔二抗以及羊抗鼠二抗购自Santa Cruz公司（美国）。

1.2 细胞系及细胞培养

PC3细胞购自中科院上海细胞库，用含20%胎牛血清、2mmol／L左旋谷氨酰胺的F12培养液置37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱培养，细胞呈单纯贴壁生长，每3～5天传代1次。传代时用0.25%胰蛋白酶消化2～3min，用培养液吹打制成细胞悬液，按所需浓度接种，接种前经锥虫蓝拒染法检测细胞活力。

1.3 MTT检测细胞增殖

取对数生长期细胞，将其密度调整为1.0×105／mL接种于96 孔细胞培养板（Costar），每孔100μL，实验组分别加入PHI使终浓度为0、5、10、20、40、80μmol／L，对照组只加10%培养液（无细胞），每组设6个平行孔，培养24、48、72、96h后，加5mg／mL MTT（Sigma）10μL，继续培养4h，离心后小心吸去上清，每孔加100μL DMSO（Sigma），充分振荡混匀，在酶标仪上用双波长492nm 和630 nm 测吸光度（A）值，计算细胞增殖率。细胞增殖率（%）＝（A实验－A空白）／（A对照－A空白）×100% 。实验重复3次。

1.4 TUNEL法原位检测细胞凋亡

取对数生长期细胞，将其密度调整为1.0×105／mL接种于6 孔细胞培养板（Costar），每孔1 mL，加入无菌盖玻片，细胞爬片48h后，分别加入PHI使终浓度为0、10、20、40μmol／L，作用7h后，取出盖玻片按照Promage试剂盒说明书步骤操作，显微镜下观察、计数200个细胞，以细胞核内出现棕色颗粒为凋亡细胞。

1.5 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测凋亡相关蛋白、组蛋白乙酰化、甲基化

收集经PHI处理后的细胞，分别用预冷的TBS洗涤2次。按1×106细胞加入100μL 裂解液和1 μL 酶抑制剂的比例裂解30 min，低温（4℃）离心1 000r／min×10min，吸取中间清亮层，用Bradford法测定总蛋白。应用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用半干电转移法转膜，室温下摇床封闭1h。加入用TBS稀释不同浓度的一抗，4℃过夜。TBS洗涤液洗膜，分别加入用TBS按1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗以及羊抗鼠二抗，室温下摇床作用1h。用化学发光法显色，X 线底片曝光，以β－actin为内参照，以目的条带与actin条带的吸光度值比来反映蛋白的表达量。对照组为无细胞组。

1.6 统计学方法

采用SPSS 12.0统计处理软件分析。常规进行方差齐性检验，正态性检验。计量资料数据以均数±标准差（±s）表示。多组数据之间的比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PHI抑制细胞增殖

图1显示0、5、10、20、40、80μmol／L PHI作用48 h 后，PC3 细胞增殖率分别为100.00%、88.39%、76.27%、44.69%、24.39%、11.50%，随药物浓度的增加增殖率逐渐下降。20μmol／L PHI作用24h时细胞增殖率为78.39%，48h为44.69%，72h为35.59%，96h为33.34%，表现出时间依赖性，IC50为20μmol／L（图2）。

图1 不同浓度PHI作用48h后PC3细胞增殖率Fig.1 Proliferation rate of PC3cells after exposure to indicated concentrations of PHI for 48h

图2 20μmol／L PHI作用不同时间后PC3 细胞增殖率Fig.2 Proliferation rate of PC3cells treated with 20μmol／L PHI for different durations

2.2 PHI诱导细胞凋亡

2.2.1 PHI上调PC3细胞凋亡率 用TUNEL法检测凋亡细胞发现，PHI可诱导PC3细胞凋亡。0、10、20、40μmol／L PHI作用7h时细胞凋亡率分别为（1.55±0.78）%、（14.30±4.32）%、（49.45±5.63）%、（76.35±6.21）%，随浓度增加而增加（图3），经过单因素方差分析显示差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 不同浓度PHI处理7h后PC3细胞凋亡率（DAB，×100）Fig.3 Apoptosis rate of PC3cells after treatment with different concentrations of PHI for 72h（DAB，×100）

2.2.2 PHI下调凋亡相关蛋白的表达 用Western blot方法检测发现，经过PHI处理后PC3细胞凋亡相关蛋白Bcl－2、Caspase－9、Caspase－3、Mcl－1、Cyt－C、XIAP的表达均下降，且随PHI浓度的增加和作用时间的延长而降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），呈时效及量效关系（图4）。

图4 不同浓度PHI处理后凋亡相关蛋白的表达变化Fig.4 Expression of apoptosis－related proteins in PC3cells treated with different concentrations of PHI

2.3 PHI上调PC3细胞组蛋白乙酰化H3、H4表达

Western blot方法检测发现，PC3 细胞组蛋白H3、H4处于低乙酰化状态。PHI能明显增加其组蛋白乙酰化H3、H4的表达，随PHI浓度的增加，其表达量增加，且随作用时间的延长其表达增强，呈现量效和时效关系。与对照组比较，PHI 10、20、40 μmol／L处理3h 后，H3 乙酰化分别增加了1.22倍、2.13倍、3.46 倍，而7h 后此变化趋势更加显著，分别增加为2.30倍、3.53倍、7.64倍。与对照组比较，处理3h 后，H4 乙酰化增加了1.09 倍、1.45倍、2.02倍，而7h后此变化趋势更加显著，分别增加了2.52倍、2.87 倍、3.50 倍，H3 乙酰化增加程度要比H4乙酰化增加明显（图5）。

2.4 PHI调控PC3细胞组蛋白甲基化H3K4、H3K9表达

PC3细胞组蛋白H3K4 处于低甲基化状态。PHI处理后H3K4甲基化水平明显增高，呈时效和量效关系，与对照组比较，PHI在10、20、40μmol／L处理3h后组蛋白甲基化H3K4水平增加了2.74倍、3.75倍、4.58倍，7h后组蛋白甲基化H3K4增加了3.66 倍、4.75 倍、5.76 倍。PC3 细胞组蛋白H3K9处于高甲基化状态，与对照组比较，PHI处理3h后对甲基化H3K9状态影响不太明显，但是处理7h后组蛋白甲基化H3K9水平降低，分别为对照组的0.65倍、0.37倍、0.22倍（图6）。

图5 PHI处理PC3细胞后组蛋白H3、H4乙酰化状态的改变Fig.5 Histone acetylation in PC3cells treated with PHI

图6 PHI处理PC3细胞后组蛋白H3K9、H3K4甲基化状态的改变Fig.6 Histone methylation in PC3cells treated with PHI

3 讨论

表观遗传是指DNA 序列不发生变化但基因表达却发生了可遗传的改变［6］。这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递［7］。表观遗传修饰主要包括DNA 启动子区的甲基化、组蛋白各种类型的修饰（乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等）、RNA 干扰等。肿瘤抑癌基因表观遗传修饰的异常改变所致的基因失活，将导致肿瘤的发生、发展。表观遗传学改变是可逆的［8］，因此，可作为肿瘤治疗的特异性标靶。目前分子遗传学研究认为，前列腺癌的发生与发展不仅与某些癌基因的活化有关，也涉及相关抑癌基因的失活。而抑癌基因失活除了与基因突变及等位基因成分缺失有关外，还与表观遗传密切相关。

随着组蛋白甲基化的研究逐渐兴起，研究发现赖氨酸甲基转移酶的家族中许多成员与肿瘤形成有关，HMT 活性缺失或失调可能是导致肿瘤发生的原因。美国一项临床研究发现，甲基化在前列腺癌患者标本中比例很高［9］。其中，组蛋白H3K9、H3K27、H3K79、H4K20位点的甲基化发挥转录抑制作用，H3K4甲基化是基因转录激活的标志，分别受到不同的甲基转移酶调控［10－11］。本研究发现PC3细胞组蛋白甲基化H3K4呈低表达，而H3K9高表达；PHI可上调组蛋白H3K4 甲基化水平，抑制H3K9甲基化的水平，即PHI可精确调控组蛋白甲基化表达，激活转录因子，启动基因的转录，从而抑制PC3肿瘤细胞的增殖，并诱导细胞凋亡。PHI能调节H3K4、H3K9的甲基化状态在经典的组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACI）曲古抑菌素（Trichostatin A，TSA）中未被发现［12］，究竟是PHI本身具有组蛋白甲基转移酶的活性，还是通过其他途径激活或募集组蛋白甲基转移酶来改变H3K9、H3K4的甲基化状态，其中的具体机制尚待进一步研究。

组蛋白乙酰化由乙酰基转移酶（HAT）和去乙酰化酶（HDAC）调节。HAT 及HDAC精确地调控染色质的结构及基因的表达。HAT 及HDAC 活性异常，或异常募集HDAC，引起抑癌基因的表达抑制或癌基因的激活和过度表达，是肿瘤发生的一个重要机制。在多种肿瘤中HDAC与细胞周期、细胞分化的调控密切相关［13－17］。

随着对组蛋白乙酰化研究的深入，发现组蛋白HDACI能通过调节组蛋白乙酰化的水平来调控表观遗传学，从而影响基因的转录，诱导肿瘤细胞凋亡或分化，引起细胞周期的阻滞，调控癌基因及抑癌基因活性，从而达到治疗肿瘤的目的。本研究结果表明，PC3细胞组蛋白呈低乙酰化，在PHI作用下，以剂量依赖及时间依赖的方式显著提高组蛋白H3和H4的乙酰化水平，激活基因转录，调控人类前列腺癌PC3细胞的表观遗传学，从而抑制细胞的增殖，诱导细胞的凋亡。

本研究证实，PHI可抑制人类前列腺癌细胞PC3的增殖，诱导细胞凋亡，其机制可能是通过内源性凋亡途径，下调凋亡抑制蛋白XIAP、Mcl－1前体（凋亡底物）的表达，从而加速肿瘤细胞的凋亡。故PHI有望成为新型的抗肿瘤药物。

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