电针耳穴对D－半乳糖致年龄相关性听力损失豚鼠听觉中枢丙二醛表达的影响△

谢仕津 殷泽登 李君梅 赖丹 欧小毅 黎万荣

随着老龄化社会的到来，年龄相关性疾病受到越来越广泛的关注。在老年人中，年龄相关性听力损失（age－related hearing loss，AHL）是仅次于关节炎和高血压的常见慢性疾病［1］。AHL 严重影响老年人的生活质量，探索AHL 发病机制和防治措施尤为重要。研究显示，针刺耳穴可有效治疗突发性聋等感音神经性聋［2，3］，但利用针刺耳穴来防治老年性聋及其机制方面的研究较少。因此，本研究通过建立D－半乳糖致年龄相关性听力损失豚鼠模型，观察电针对其听功能以及听皮层、下丘和耳蜗核组织中丙二醛表达的影响，以探讨丙二醛在AHL发病中的作用、电针对AHL的防治作用及机制，为电针防治AHL提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选取耳廓反射灵敏、无噪声暴露及耳毒性药物使用史的4月龄豚鼠30只（体重300～550g），饲养适应一周后，随机分为对照组、D－半乳糖模型组、D－半乳糖＋电针组，每组10只。2年龄豚鼠10只（体重600～900g）为老年组，由泸州医学院实验动物中心提供。

D－半乳糖模型组于豚鼠颈背部皮下注射D－半乳糖［4～6］（C6H1206，AID SCIENCE，中国）300 mg·kg－1·d－1（40mg／ml），每日1次，连续6周。D－半乳糖＋电针组D－半乳糖的用法及用量同模型组，同时予以电针刺听宫、翳风两个穴位。对照组给予等量生理盐水颈背部皮下注射，每天1次，连续6周。2年龄组不做任何处理，常规饲养。在饲养过程中，仔细观察各组动物的外观及表现。

1.2 实验方法

1.2.1 电针 动物清醒状态下，用自制装置固定，取双侧听宫、翳风穴［7］，用HM6805－I型经穴治疗仪（HM6805－I型，1100801072，四川恒明科技开发有限公司）刺激，疏密波，频率14Hz，强度0.4～0.6 mA，连续输出，9 次／秒，持续刺激15 min，每天一次，连续针刺6周。

1.2.2 ABR 波Ⅲ潜伏期检测 于实验结束后对各组豚鼠行ABR 检测，采用华中科技大学附属协和医院耳鼻咽喉听力室建立的方法进行［8］。动物用10%水合氯醛350mg／kg行腹腔注射麻醉，用脑干诱发电位仪（Intelligent Hearing Systems，美国智听公司）测试，刺激声为短声（click），观察110dB SPL刺激强度下各组豚鼠波Ⅲ潜伏期的变化。

1.2.3 丙二醛含量的检测 测试ABR 后，动物麻醉未醒前，断头、取双侧听皮层、下丘、耳蜗核，立即用4 ℃生理盐水洗净血迹，放入－80 ℃冰箱中保存。硫代巴比妥酸法（TBA）法检测丙二醛含量，操作步骤按丙二醛测试盒（20110110，南京建成生物工程研究所）说明进行。按下列公式计算样品中丙二醛的含量：组织中丙二醛含量（nmol／mgprot）＝［（测定管OD 值一测定空白管OD 值）／（标准管OD值－标准空白管OD 值）］×标准品浓度（10nmol／ml）／蛋白含量（mgprot／ml）。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0软件，应用单因素方差分析对各组间结果差异进行比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 豚鼠外观观察 D－半乳糖模型组和老年组豚鼠毛色枯槁，无光泽，且头顶部、背部、腹部掉毛严重；D－半乳糖模型组自造模4 周起，出现精神萎靡，倦怠嗜睡，进食减少，皮肤松弛，行动迟缓，自主活动减少。对照组外观及表现如实验前，D－半乳糖＋电针组外观及表现介于D－半乳糖模型组和对照组之间。

2.2 各组豚鼠ABRⅢ波潜伏期的变化 刺激声强度为110dB SPL 时，对照组、D－半乳糖模型组、D－半乳糖＋电针组和老年组ABR 波Ⅲ的潜伏期分别为0.89±0.88、1.06±0.14、0.90±0.10和1.00±0.10ms。与对照组比较，D－半乳糖模型组和老年组波Ⅲ潜伏期延长（P＜0.05）；与D－半乳糖模型组比较，D－半乳糖＋电针组波Ⅲ潜伏期缩短（P＜0.05）；D－半乳糖模型组与老年组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 各组豚鼠听皮层、下丘、耳蜗核中丙二醛的表达情况 与对照组相比，D－半乳糖模型组和老年组豚鼠听皮层、下丘、耳蜗核中丙二醛含量升高（P＜0.05）；与D－半乳糖模型组相比，D－半乳糖＋电针组三个部位丙二醛含量降低（P＜0.05）；D－半乳糖模型组与老年组相比，两组之间丙二醛含量差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

3 讨论

表1 各组豚鼠听皮层丙二醛表达情况的比较（nmol／mgprot，±s）

表1 各组豚鼠听皮层丙二醛表达情况的比较（nmol／mgprot，±s）

注：＊与对照组比较，P＜0.05；△与D－半乳糖模型组比较，P＜0.05

组别听皮层下丘耳蜗核对照组1.17±0.34 0.81±0.22 2.27±0.56 D－半乳糖模型组 2.41±0.87＊1.61±0.70＊ 3.13±0.91＊D－半乳糖模型＋电针组1.45±0.88△0.98±0.20△ 2.16±0.73△老年组2.64±0.86＊1.74±0.62＊ 3.26±0.70＊

3.1 丙二醛在D－半乳糖致豚鼠年龄相关性听力损失发病中的作用 近年来，自由基学说在AHL发生机制中的作用日益受到关注。随着年龄的增加，机体抗氧化功能下降，氧自由基增多。氧自由基作用于脂质发生过氧化反应，可形成过氧化脂质，后者分解产生丙二醛。丙二醛能交联蛋白质与核酸，影响细胞的基因表达和蛋白质的合成，还可导致线粒体膜损伤影响氧化磷酸化过程［9］，其含量的高低反映了细胞受氧自由基攻击的严重程度。氧自由基可引起耳蜗毛细胞内钙超载而死亡，从而导致AHL的发生［10］。本研究中，老年组豚鼠听皮层、下丘和耳蜗核中丙二醛的含量均明显增加，说明丙二醛参与了老年性聋的发生，而本研究中D－半乳糖模型组各级听觉中枢中丙二醛的表达也显著增加，说明氧自由基增加所致的氧化损伤机制可能参与了D－半乳糖所致的豚鼠AHL，这与周媛等［11］的研究结果类似。丙二醛导致听觉中枢老化的机制可能与耳蜗的自由基氧化损伤机制相似［12］，当然，这还需要进一步研究证实。

3.2 电针刺耳穴对D－半乳糖致豚鼠年龄相关性聋的干预作用及机制 衰老机制的自由基学说［13］认为：随着年龄增长，抗氧化酶活性下降，自由基对机体损伤累积进而引起了衰老现象，在听觉系统表现为听力下降。因此，从抗氧化角度寻找能够延缓、阻止疾病进程的治疗方法是目前AHL 临床研究的主要方向之一。研究表明，针刺可明显降低D－半乳糖诱导的亚急性衰老小鼠和老年痴呆模型大鼠脑组织中丙二醛的含量，减少脂质过氧化反应和丙二醛生成，减少神经元的损伤，从而起到保护脑细胞、延缓衰老的作用［14，15］。本实验结果显示，与D－半乳糖模型组相比，D－半乳糖模型＋电针组豚鼠ABR 波Ⅲ潜伏期缩短，听皮层、下丘和耳蜗核中丙二醛含量显著降低，说明电针治疗可以降低听觉中枢中丙二醛的产生，减少听觉中枢神经元的氧化损伤，从而延缓AHL的发生，但具体的信号转导机制还需进一步研究。

研究表明，经络的循行与神经、血管、淋巴管的循行分布基本一致，与人体应激系统也有密切关系［16］。针刺穴位作用于人体经络，能够促进血液运行，改善人体的新陈代谢，研究还发现，电针可加快耳部的血液循环、改善血液流变学的指标，为耳神经功能的恢复提供了物质基础，使听力得以恢复［17］。本研究根据针灸的“治未病”思想［18］，以针刺耳周腧穴防治老年性聋。听宫为手太阳小肠经之穴，其经脉入耳中，翳风为手少阳三焦经之穴，其经脉沿耳后入耳中，出耳前；根据现代解剖学，听宫穴有颞浅动脉的耳前支，有耳颞神经分布，深部有颞浅动脉出发处，翳风穴下布有耳大神经、耳颞神经、颈外动脉、静脉及迷走神经等［19］，故针刺听宫、翳风穴，可激发经气，疏通耳部经络，增强耳脉气血的运行，平衡阴阳，调整内耳功能。另外，针刺能提高听神经以及外侧丘系桥脑的兴奋性和传导性、增强皮层对声音感受的代偿能力，从而改善听功能［20］。本实验结果显示，针刺听宫、翳风二穴可明显改善豚鼠的听功能，表明针刺听宫、翳风穴位，可能通过增加耳蜗和听觉中枢的血流量、改善听觉中枢神经元的新陈代谢、提高蜗神经和各级听觉中枢的兴奋性和传导性，提高皮层对声音信息的利用，从而延缓年龄相关性听力损失的发生。但其具体信号转导机制还需进一步研究。

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