进行性非综合征型聋家系临床表型及遗传学分析＊

李征玥 程静 卢宇 张旭 金占国 贾婧杰 袁慧军

耳聋是导致言语交流障碍的常见疾病，是最常见的出生缺陷。每500个新生儿中就有1个出现双侧听力损失≥40dB的永久性感音神经性聋；到青春期，这一比例上升到3.5／1000［1］。遗传原因在耳聋致病因素中占60%，绝大部分病例为遗传和环境等多因素共同作用的结果［2］。

由遗传因素引起的耳聋可分为综合征型（约30%）和非综合征型（NSHL，约70%）。在非综合征型聋中，按照耳聋的遗传方式，可以分为常染色体显性遗传（DFNA，约70%）、常染色体隐性遗传（DFNB，约15% ～20%）、X 染色体连锁遗传（DFNX，约1%）、Y 染色体连锁遗传（DFNY）及线粒体突变（两者小于1%）［2～4］。目前常染色体显性遗传性非综合征型聋的致病基因已经排序到DFNA64，定位了54 个DFNA 基因位点（http：／／hereditaryhearingloss.org）。本研究应用微卫星标记对一个DFNA 家系的22个位点23个基因进行筛查，现将该家系的临床表型及遗传学特征报告如下。

1 资料与方法

1.1 家系资料 先证者来自中国人民解放军总医院耳鼻咽喉－头颈外科门诊，通过对该耳聋患者的追踪调查获得一个五代的耳聋家系，该家系位于河南省范县。根据解放军总医院分子诊断中心的聋病资料库编号，该家系命名为HN－Z50。2010 年6月解放军总医院耳鼻咽喉科研究所聋病分子诊断中心家系采集小组到家系成员居住地对此家系进行了详实的家系资料调查。现存家系成员44人，其中因在外地打工而未获得家系资料5人，参加本研究的39名家系成员均签署了知情同意书并进行了全身各系统的检查及粗略的智力评估和听力学检查，以排除综合征型聋。抽取相关成员的外周静脉血5～10ml，用于基因组DNA 的提取及保存。该项目的伦理论证由解放军总医院伦理委员会批准。

1.2 临床听力学检测 应用Madsen 502 便携式听力计（丹麦），EAR3A 插入式耳机（美国）进行家系成员的纯音测听，测试双耳125～8 000 Hz的气骨导听阈。应用Madsen 901（丹麦）声导抗检测仪进行声导抗检查，了解中耳状况。先证者在解放军总医院进行了畸变产物耳声发射、听性脑干反应、前庭功能及颞骨CT 检查。

1.3 耳聋表型的判断标准 本研究的耳聋表型分析判断标准参照《关于非综合征型遗传性聋家系遗传学及听力学描述术语建议案》［5，6］：①根据是否伴有全身其他器官系统的异常分为非综合征型聋、综合征型聋；②根据听力损失的性质分为传导性聋、感音神经性聋及混合性聋；③根据语言发育阶段分为语前聋、语后聋；④根据听力损失的频率分为：高频听力损失型（2～8kHz听力下降为主），中频听力损失型（0.5～2kHz听力下降为主），低频听力损失型（0.25～0.5kHz听力下降为主），全频听力损失型（0.25～8kHz听力下降）；⑤听力损失程度按照两耳中听力较好一耳的平均听阈（0.5～4kHz听阈的平均值）评估：20～40dB HL为轻度听力损失，41～70dB HL为中度听力损失，71～95dB HL 为重度听力损失，＞95dB HL为极重度听力损失。

1.4 已知DFNA 遗传位点筛查 查询DFNA 位点中已克隆的19个耳聋基因位点在染色体特定区域的物理距离（http：／／genome.ucsc.edu／），并在http：／／www.marshfieldclinic.org／research／pages／index.aspx中选取与与基因物理距离相近的微卫星标记1～2 个，对每个微卫星标记的上游引物5’端用FAM 荧光染料标记（引物由上海英俊生物技术有限公司合成）。应用ABI veriti热循环仪进行PCR 反应，PCR 反应体系为5 μl（包含1 μgDNA，每对引物各0.05μl，0.5μl 10xbuffer，0.3 μl Mg2＋，0.8μl dNTP，1μl Q solution，0.05μl的Hotstar Taq DNA 聚合酶，双蒸馏水补至5μl），反应条件采用“Touchdown”方式，用ABI 3130xl Genetic Analysis测序仪进行PCR 扩增产物的变性和上样，GeneMaker（version 1.65）软件进行微卫星标记分析。分析结果输入LINKAGE DESIGNER软件得到＊.pre、＊.dat、＊.mdf相关参数文件，采用LINKAGE（5.1version）软件进行连锁分析，并计算LOD 值。LOD 值＞1 支持连锁，LOD 值≥3提示肯定连锁，－2＜LOD 值＜3 提示可能连锁需增加家系材料，LOD 值＜－2提示不连锁［7］。

2 结果

2.1 HN－Z50家系的听力学诊断及病史 39 人中，16人诊断为双侧感音神经性聋，耳聋患者年龄最大76岁（II：3），最小17 岁（IV：17）。除IV：10外，余15名患者均表现为迟发性语后渐进性听力损失，伴双侧高频耳鸣，发病年龄14～40岁，早期以中频听力下降为主，随着年龄增加，逐渐累及全频，呈下降型听力曲线，无眩晕及耳毒性药物应用史。IV：10表现为先天性听力损失，不会说话，自幼有多次氨基糖苷类药物应用史，无耳鸣。所有患者全身其他系统均未见异常。

2.2 HN－Z50家系典型耳聋患者临床听力学特征分析 图1为先证者IV：7的听力图。女，27岁，足月顺产，出生后对声音反应良好，学语正常，18岁时出现双耳听力下降并伴有双侧高频耳鸣，此后自觉听力下降程度逐渐加重，无眩晕等其他伴随症状，无高血压、糖尿病等疾病。双耳各频率均未引出DPOAE，听性脑干反应检查示双侧I－V 波间期正常，前庭功能检查正常。颞骨CT 扫描示中耳及内耳结构正常，纯音测听示中高频听力损失为主，听力曲线为覆盆型，听力损失程度为中度。

图2为III：12 听力图。男，43岁，为家系中第三代成员，语言能力好。16岁时出现双耳听力下降并伴有双耳高频间断性耳鸣，自觉听力下降逐年加重；无眩晕，无噪声接触史，无高血压、糖尿病、心脑血管疾病史；纯音测听显示为全频听力下降，听力曲线呈陡坡型，听力损失程度为重度。

图3为II：3听力图。女，76岁，为家系患病成员中年龄最大者，语言能力好。12岁时出现双耳高频耳鸣，25岁出现听力下降，无眩晕等其他伴随症状；纯音测听示全频听力损失，以中高频听力下降为主，听力曲线呈陡坡型，听力损失程度为极重度。

图4为IV：10听力图。男，22 岁，出生时父母发现其对声音反应较常人差，至今不会说话，幼年时有多次耳毒性药物应用史，自觉听力无明显变化，无耳鸣、眩晕等其他症状，智力正常。

2.3 HN－Z50家系遗传学特征分析 应用Cyril－lic2.1软件根据家系调查及检查结果绘制家系谱图（图5），可见，该家系共5代，各代连续发病，现存患者分布于第2～4代，男女均可发病，男女患者比例为11∶7。家系中最初患者为男性（I：1）；第II代有3人，共2人患病，患病率为66.67%（2／3）；第III代为10人，未获得家系资料1人，余9人中8人为耳聋患者，患病率为88.89%（8／9）；第IV 代共21人，未获得家系资料4人，余17人中7人纯音测听显示听力下降，患病率41.18%（7／17）；第V 代共1人，听力正常。第IV、V 代患病率下降，可能原因为家系成员尚年轻，未到发病年龄，暂未表现出耳聋、耳鸣症状。除IV：10外，所有耳聋患者均表现为语后进行性听力损失，伴双侧高频耳鸣，IV：10考虑可能为非家系致聋基因导致的耳聋。由此可见，HNZ50家系符合典型的常染色体显性遗传特点。

图1 先证者IV：7 双耳听力图（女，27岁）图2 患者III：12 双耳听力图（男，43岁）图3 患者II：3 双耳听力图（女，76岁）图4 患者IV：10 双耳听力图（男，22岁）

图5 HN－Z50家系系谱图

2.4 HN－Z50家系微卫星标记筛查结果 HNZ50家系22 个DFNA 位点的23 个已知常染色体显性遗传性聋致病基因附近的微卫星遗传标记连锁分析结果如表1所示，除DFNA5的两个遗传标记LOD值分别为2.08和1.89，不否定连锁外，其余耳聋基因附近的遗传标记LOD值均＜－2，否定连锁。

2.5 HN－Z50家系部分成员DFNA5基因筛查结果 分别取家系中2名患者（II：3、III：7）及2名正常人（II：5、III：16）进行DFNA5基因全部外显子测序，均未发现突变。

表1 22个DFNA 位点的20个遗传标记及LOD值

3 讨论

本研究中HN－Z50家系耳聋家系图谱分析表明，该家系的耳聋遗传方式表现为典型的孟德尔常染色体显性遗传。根据患者病史及听力图可得出，该家系为语后聋，听力下降程度呈进行型，发病早期以中频听力下降为主，听力曲线为覆盆型，下降程度为轻中度，此后逐渐累及高频，随着年龄的增长，呈全频听力下降，听力曲线呈陡坡型，下降程度至极重度。

但该家系有一名耳聋患者IV：10情况特殊，需要鉴别。IV：10患者无语言能力，能正常发音，无智力异常，表明其发病年龄在学语阶段或学语前。虽然患者有多次耳毒性药物应用史，但都在学语后，考虑与其耳聋原因无关。而该家系其他耳聋患者发病年龄均在语言形成之后，与IV：10不一致，由此推测IV：10耳聋的原因可能并非该家系的致聋基因引起，而可能是其他耳聋基因。

迄今为止，已报道的非综合征型耳聋基因位点已达到166 个，包括DFNA64 个，DFNB95 个，DFNX6 个，DFNY1 个（http：／／hereditaryhearingloss.org），其中已克隆的DFNA 基因有23 个。DFNA 型耳聋基因型和表型存在着一定的因果关系，在已定位的DFNA 位点中，以低频听力损失为主的有：DFNA1、DFNA6／14／38、DFNA7／54、DFNA57；以中频下降为主的有：DFNA10、DFNA13、DFNA8／12；以高频听力下降的，有：DFNA2、DF－NA3、DFNA4、DFNA5、DFNA7、DFNA9、DFNA11、DFNA15、DFNA16、DFNA17、DFNA18、DFNA19、DFNA20／26、DFNA21、DFNA22、DFNA23、DFNA25、DFNA27、DFNA28、DFNA30、DFNA31、DFNA34、DFNA36、DFNA37、DFNA39、DFNA41、DFNA42、DFNA44、DFNA48、DFNA53、DFNA58、DFNA59、DFNA64；以全频听力下降或语前聋的有：DFNA24、DFNA32、DFNA43、DFNA47、DFNA49、DFNA57、DFNA59。

目前在进行常染色体显性遗传性聋家系基因定位研究中最常用的方法为：①对已克隆的表型相似的基因直接测序或STR 遗传标记计算LOD 值，排除已知的DFNA 基因；②对已克隆的表型不同的基因直接测序或STR 遗传标记计算LOD 值，排除已知的DFNA 基因；③应用其他方法定位新的常染色体显性遗传性聋基因［8］。

与本研究家系HN－Z50 相关的基因有DFNA10（EYA4）、DFNA13（COL11A2）、DFNA8／12

（TECTA）。EYA4基因位于6q22.3，共有21个外显子，cDNA 全长1920bp，编码639个氨基酸，属于eya基因家族的一员，是调节眼部发育和Corti器功能成熟的关键基因［9］。1996年由O＇Neill等［10］在美国和比利时的DFNA10家系中发现该基因突变可以引起常染色体显性遗传性聋，主要表现为语后、以中频下降为主的感音神经性聋，后期可累及全频。

COL11A2位于6p21.3，含有66 个外显子，长28 000bp，主要在软骨中表达［11］。该基因突变可以引起DFNA13，主要为中频听力损失。电子显微镜下显示干扰Col11a2表达的小鼠盖膜组织存在胶原纤维的损失，内耳存在超微结构畸形导致盖膜异常，这可能是其导致听力损失的原因之一［12］。

TECTA 基因是Kirschhofer［13］1998年在一个澳大利亚耳聋家系中首次发现，定位在11q23～q25，包含23个外显子，全长6 466bp。TECTA 编码alpha—tectorin 蛋白是分布于耳蜗盖膜的一种主要的非胶原成分。声音传到耳蜗后，首先要引起前庭膜和盖膜的振动，才能引起毛细胞的兴奋，所以盖膜在声音传导的过程中起着重要的作用。该基因突变可以导致中频中重度听力损失。

本研究对与HN－Z50家系表型相似的上述3个位点的基因及其他19个位点的20个基因进行了连锁分析筛查，结果显示，除DFNA5外，其余位点均否定连锁。为了确定家系致病基因是否为DFNA5，应对家系中所有成员进行DFNA5全外显子测序，但为了节约成本，首先选取了家系中诊断明确的2名患者及2名正常人进行测序，结果表明，II：3、III：7、II：5、III：16DFNA5 基因全外显子均无突变，由此可排除DFNA5为该家系致聋基因。

对HN－Z50家系的研究策略首先为判断该家系是否与已知的DFNA 位点连锁，如不连锁，则提示可能为一新的耳聋位点。本研究应用微卫星标记连锁分析及直接测序的方法筛查了DFNA22个位点的23个基因，结果均为阴性。

新一代测序技术（next－generation sequencing technology，NGS）的主要原理是在芯片上固定大量被测的模板DNA 片段，其上杂交结合通用的DNA引物，应用不同的方法产生上百万甚至更多的单分子多拷贝PCR 克隆阵列，随后进行引物杂交及酶的延伸。该技术的特点是一次可以读取分析最多几百万条DNA 序列，相对成本较低，节省时间，这是传统的测序技术不能达到的。NGS目前已经成为耳聋致病基因研究首选工具，2010年Rehman［14］等利用NGS对一个常染色体隐性遗传性聋家系进行了分析，将致病基因定位在了染色体9q34.3的2.9Mb区域内，经过计算机分析，找到了该家系的致病基因TPRN；同年，Shearer［15］等对已经通过传统Sanger Sequencing确诊的9名遗传性聋患者进行NGS测序，结果一致，由此也证明了NGS的可靠性。因此，下一步将通过NGS对该家系成员进行全外显子测序，找寻致病基因。

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