大孔吸附树脂纯化延胡索总生物碱工艺研究

吕子明 刘文娟 于向红 杨志云 梁俊清 屠鹏飞

1.北京大学药学院 天然药物及仿生药物国家重点实验室，北京 100191；2.北京以岭药业有限公司，北京 100027

延胡索为罂粟科植物Corydalis yanhusuo W.T.Wang的干燥块茎，具有活血化瘀、理气止痛之功效[1]。现代药理学研究表明，延胡索具有抗溃疡、抑制胃酸分泌、解痉及增加冠状动脉血流量、抗心律失常等作用[2]。延胡索生物碱包括叔胺碱和季胺碱，是其主要活性成分。目前，大孔树脂在中草药有效成分的分离、富集中的应用越来越受到人们的重视[3]。本文旨在优选出一种适合纯化延胡索总生物碱的大孔树脂，并对优选出的大孔树脂纯化延胡索总生物碱时的工艺条件及参数进行研究。

1 仪器与材料

UV-2550紫外分光光度计（日本岛津公司）；Agilent 1100 Series高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Sartorius BS 110电子天平（德国赛多利斯公司）；延胡索药材（购于河北省安国以岭饮片有限公司，经鉴定，符合《中国药典》2010年版一部标准，批号：070902）；延胡索乙素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：0726-200208）；大孔吸附树脂NKA-9（南开大 学）；HPD600、HPD500、HPD-450、HPD-400A、HPD-400、HPD100A（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）；AB-8、D101、DM-130、D-100、D141（中蓝晨光化工研究院物资公司）。95%乙醇（药用规格，天津市科密欧化学试剂有限公司）；水为纯化水，其他试剂均为分析纯（北京化工厂）。

2 方法与结果

2.1 上柱药液的制备

取延胡索药材2 kg，用8倍量体积分数为60%乙醇提取3次，每次1.5 h。合并提取液，减压浓缩至无醇味。加水定容至9 000 mL，抽滤，备用。

2.2 含量测定

2.2.1 总生物碱的含量测定

2.2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取延胡索乙素对照品适量，加甲醇制成1 mL含204.8μg的溶液，即得。

2.2.1.2 线性关系考察 精密吸取延胡索乙素对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，在280 nm处测定。以标准品延胡索乙素的浓度（X1）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程：Y1=0.001 5X1-0.000 4，r=0.999 9。延胡索乙素在8.192 0～40.960 0μg/mL之间具有良好的线性关系。

2.2.1.3 供试品溶液制备 精密吸取样品溶液10 mL，上中性氧化铝柱，30 mL乙醇洗脱，流出液及洗脱液收集至50 mL量瓶中，乙醇定容至刻度；精密吸取10 mL，加乙醇稀释至50 mL，摇匀，测定。

2.2.1.4 精密度试验 选取某一浓度的对照品溶液，连续测7次，按上述条件测定吸光度。结果精密度良好，RSD=0.46%。

2.2.1.5 稳定性试验 选取某一浓度的对照品溶液，按上述条件测定吸光度，间隔8 h测定1次，结果24 h内稳定，RSD=2.7%。

2.2.1.6 重复性试验 精密吸取样品溶液10 mL，按“2.2.1.3”项下方法，制备供试品溶液5份，进行含量测定，测定结果RSD=1.3%。

2.2.1.7 加样回收率试验 以重复性实验所得总生物碱平均含量为样品溶液含量，精密吸取样品溶液5份，加入等量对照品溶液，按“2.2.1.3”项下方法操作，计算总生物碱回收率为101.3%，RSD=1.07%。结果表明方法准确可靠。

2.2.2 延胡索乙素的含量测定

2.2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，0.5μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（三乙胺调pH 6.4）（52∶48）；流速：1.0 mL/min；柱温：室温；检测波长：280 nm；进样量：10μL。理论板数按延胡索乙素峰计算应不低于3 000。

2.2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取延胡索乙素对照品适量，加甲醇制成1 mL含46.3μg的溶液，即得。

2.2.2.3 线性关系考察 精密吸取延胡索乙素对照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μL，在上述色谱条件下进行试验，测定峰面积。以对照品延胡索乙素的量（X）为横坐标，吸收峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，进行线性回归处理，得回归方程：Y=36.425X+0.28，r=0.999 4。由此可知，延胡索乙素的进样量在0.432 8～2.164 0μg范围内，其峰面积与进样量呈良好的线性关系。

2.2.2.4 精密度实验 选取某一浓度的对照品溶液，连续进样7次，按上述条件测定峰面积。结果精密度良好，RSD=0.37%。

2.2.2.5 稳定性试验 选取某一浓度的对照品溶液，按上述色谱条件测定峰面积，间隔6 h测定1次，结果24 h内稳定，RSD=2.3%。

2.2.2.6 重复性试验 精密吸取样品溶液10 mL，按“2.2.2.1”项下方法，制备样品溶液5份，进行含量测定，测定结果RSD=1.1%。

2.2.2.7 加样回收率试验 以重复性实验所得延胡索乙素平均含量为供试品溶液含量，精密吸取供试品溶液5份，加入等量对照品溶液，按“2.2.2.1”项下方法操作，计算延胡索乙素回收率为101.7%，RSD=2.8%。结果表明方法准确可靠。

2.3 大孔吸附树脂的预处理

树脂预处理：分别取极性树脂NKA-9、HPD600、HPD500，中等极性树脂HPD-450、HPD-400A、HPD-400，弱极性树脂AB-8、DM-130、D-100，非极性树脂HPD100A、D101、D141适量于体积分数为95%的乙醇（以下乙醇浓度皆为体积分数）浸泡24 h后，湿法装柱，并用95%乙醇动态洗脱5 BV，水洗至无醇味，依次用质量分数5%盐酸（浸泡6 h后，水洗至中性）和质量分数5%氢氧化钠（浸泡6 h后，水洗至中性）处理，最后用95%乙醇动态洗脱至流出液加水（体积比1∶5）不变混浊为止，用水置换出乙醇后备用。

2.4 大孔吸附树脂的筛选

取20 mL不同型号已处理好的树脂分别装入色谱柱，测定死体积后，将一定浓度样品溶液通过树脂柱，以相同流速1.5 BV/h进行动态吸附，TLC检测（Dragendorff反应检识生物碱，Molish反应检识糖或糖苷类化合物）泄漏点，预试药液泄漏前的上样体积。HPD500、NKA-9、HPD600、HPD450、HPD400A、HPD400、AB-8、DM-130、D-100、D-141、HPD100A、D101的上样量分别为310、75、110、325、150、175、350、160、350、350、300、300 mL。结果表明，HPD500、HPD-450、AB-8、D-100、HPD100A、D101、D141 7种树脂用于延胡索总生物碱的吸附效果较好，因此选择这7种树脂继续进一步考察。

将选择的7种树脂上样后用水洗脱除杂，水洗体积为110 mL，流速为2 BV/h。观察发现：D101树脂水洗液中溶解有大量生物碱，水洗液颜色较其他树脂明显深很多，说明该树脂对延胡索生物碱的吸附量较小，不宜选用。用乙醇洗脱剩下的6种上样树脂，合并洗脱液于500 mL量瓶中，95%乙醇定容至刻度，摇匀，测定总生物碱含量和延胡索乙素的含量。结果见表1、2。

表1 不同树脂类型对洗液中总生物碱及延胡索乙素的筛选结果

表2 不同树脂类型对总生物碱及延胡索乙素的筛选结果

由表1和表2结果可知，AB-8、D-141、D-100吸附量和解析率较优，做进一步考察。

分别取AB-8、D-141、D-100树脂各25 mL，上样，用TLC薄层检测结合紫外分光光度法确定上样量，然后用水洗除杂，再用不同浓度乙醇冲洗，结果见表3。

表3 不同树脂类型上样量及洗液体积的筛选结果

由表3结果可知，D-141树脂效果较好，因此确定用D-141树脂纯化延胡索总生物碱。

2.5 吸附过程参数考察

2.5.1 上样浓度考察

将不同浓度的上样溶液0.25 g生药/mL（125 mL）、0.35 g生药/mL（90 mL）、0.5 g生药/mL（75 mL）、0.625 g生药/mL（50 mL），通过D141树脂柱（树脂水体积10 mL，径高比1∶6），进行动态吸附，吸附完全所用时间为3 h，每个上样浓度接馏分10份，进行TLC检测，结果上样体积分别为125、90、75、50 mL；上样浓度为0.25 g生药/mL在第6份泄漏生物碱，后3个浓度在第7份泄漏生物碱。考虑到上样过程同时也是除杂过程，应该是上样体积越大除去的杂质越多，从该角度考虑0.35 g生药/mL的上样浓度比较合适。

2.5.2 径高比考察

选择直径相同的色谱柱3根，湿法装入D141树脂，使树脂径高比分别达到1∶4、1∶6、1∶10，取浓度为0.35 g生药/mL的样品溶液通过树脂柱，进行动态吸附（4 BV/h），待吸附完全后，用8 BV纯净水洗脱除杂，后用4 BV 60%乙醇+4 BV 90%乙醇洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中总碱的量及总浸膏的量，结果为树脂径高比分别为1∶4、1∶6、1∶10时，总浸膏量分别为541.8、549.1、459.4 mg；总生物碱量分别为312.4、329.9、321.7 mg。结果表明，选择树脂径高比1∶6较好。

2.5.3 吸附流速考察

选择直径相同的色谱柱3根，湿法装入D141树脂，树脂径高比1∶6，取浓度为0.35 g生药/mL的样品溶液分别以2 BV/h、3 BV/h、4 BV/h通过树脂柱，进行动态吸附，待吸附完全后，用8 BV纯净水洗脱除杂，后用4 BV 60%乙醇+4 BV 90%乙醇洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中总碱的量及总浸膏的量。结果为吸附流速为2 BV/h、3 BV/h、4 BV/h，总浸膏量为491.6、471.1、494.6 mg，总生物碱量为319.8、316.8、316.1 mg。表明吸附流速4 BV/h较好。

2.5.4 泄漏点考察

取色谱柱1根，湿法装入D141树脂，树脂径高比1∶6，取浓度为0.35 g生药/mL的样品溶液分以4 BV/h通过树脂柱，进行动态吸附，接馏份10份，每份10 mL，薄层检测，结果显示，上样80 mL生物碱开始泄漏，所以最大上样量确定为80 mL。

2.6 除杂过程各参数考察

2.6.1 除杂溶剂考察

取浓度为0.35 g生药/mL的上样溶液80 mL，4份，分别以2 BV/h的流速通过4根大孔树脂色谱柱（树脂体积为10 mL，径高比为1∶6），待吸附完全后，分别用常温纯净水，冷藏纯净水，质量分数1% NaCl溶液（以下NaCl浓度皆为质量分数），质量分数2.5%氨水（以下氨水浓度皆为质量分数））洗脱除杂，TLC检测结合目测优选洗脱溶剂。结果表明，常温纯净水、冷藏纯净水和2.5%氨水洗脱液都含有生物碱，颜色都较深，而1% NaCl溶液洗脱液不含生物碱，颜色最浅。结果表明，1%NaCl溶液做除杂溶剂较好。

2.6.2 NaCl溶液洗脱浓度及洗脱体积考察

取浓度为0.35 g生药/mL的上样溶液80 mL，3份，分别以2 BV/h的流速通过3根大孔树脂色谱柱（树脂体积为10 mL，径高比为1∶6），待吸附完全后，分别用0.3%、0.6%、1% NaCl溶液洗除杂（接除杂馏分，共接7份，前2份每份15 mL，后5份每份10 mL），TLC检测结合目测优洗脱溶剂浓度，确定洗脱溶剂浓度后，采用Molish反应（检识糖或糖苷类化合物）确定除杂体积。0.3% NaCl溶液洗脱时，洗脱30 mL（3 BV）后Molish反应已呈阴性，说明糖已除掉，70 mL（7 BV）后已无其他杂质洗脱下来。考虑到尽量降低NaCl的浓度和节约成本，结果为0.3% NaCl溶液较合适，洗脱体积为7 BV，再用1 BV水洗脱除掉NaCl（硝酸银反应检识Cl-），最终洗脱体积为8 BV。

2.7 洗脱过程各参数考察

2.7.1 洗脱溶剂浓度考察

取浓度为0.35 g生药/mL的上样溶液80 mL，8份，分别以2 BV/h的流速通过8根大孔树脂色谱柱（树脂体积为10 mL，径高比为1∶6），待吸附完全后，分别用0.3% NaCl溶液7 BV+纯净水1 BV洗脱除杂，然后用30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%的乙醇各8 BV分别洗脱，收集洗脱液于100 mL量瓶中，并用洗脱液定容，TLC检测以及HPLC指纹图谱分析检测生物碱，同时测定总生物碱含量及转移率。结果显示，随着乙醇浓度的升高，洗脱液中总生物碱的含量增加，90%乙醇洗脱时最大，总生物碱的转移率为86.95%。该结果不是很理想，继续考察。取浓度为0.35 g生药/mL的上样溶液80 mL，3份，分别以2 BV/h的流速通过3根大孔树脂色谱柱（树脂体积为10 mL，径高比为1∶6），待吸附完全后，分别用0.3%NaCl溶液7 BV+纯净水1 BV洗脱除杂，然后分别用4 BV 60%+4 BV 90%乙醇、4 BV 70%+4 BV 90%及4 BV 90%+4 BV 60%乙醇分别洗脱，收集洗脱液于100 mL量瓶中，并用95%乙醇定容，测定总生物碱含量及转移率，结果出膏量分别为565.62、560.65、559.43 mg；总生物碱转移率分别为88.11%、87.33%、87.14%；出膏率分别为11.61%、11.38%、11.31%。结果表明，4 BV 60%+4 BV 90%乙醇洗脱浓度较好。

2.7.2 洗脱流速考察

取浓度为0.35 g生药/mL的上样溶液80 mL，共3份，分别以4 BV/h的流速通过3根大孔吸附树脂色谱柱（树脂体积为10 mL，径高比为1∶6），待吸附完全后，分别用0.3% NaCl溶液7 BV+纯净水1 BV洗脱除杂，然后用4 BV 60%+4 BV 90%的乙醇分别以4 BV/h、5.5 BV/h、8 BV/h洗脱，收集洗脱液于100 mL量瓶中，并用洗脱液定容，检测洗脱液出膏量分别为493.9 mg、497.8 mg和488.8 mg；总生物碱的量分别为346.8 mg、398.3 mg和359.5 mg。从结果可以看出洗脱流速为5.5 BV/h时较合适。

2.7.3 洗脱体积考察

2.7.3.1 考察60%乙醇洗脱曲线 取浓度为0.35 g生药/mL的上样溶液80 mL，以4 BV/h的流速通过大孔树脂色谱柱（树脂体积为10 mL，径高比为1∶6），待吸附完全后，用0.3%NaCl溶液7 BV+纯净水1 BV洗脱除杂，然后用8 BV 60%乙醇以5.5 BV/h洗脱，接收洗脱液，每10毫升为1份，检测每份洗脱 液 中 总 生 物 碱 的 量 分 别 为55.9、124.75，33.7、32.0、21.3、16.8、13.0、10.8和10.1 mg。结果表明，3～4 BV洗脱较合适。

2.7.3.2 考察90%乙醇洗脱曲线 取浓度为0.35 g生药/mL的上样溶液100 mL，以4 BV/h的流速通过大孔树脂色谱柱（树脂体积为10 mL，径高比为1∶6），待吸附完全后，用0.3%NaCl溶液7 BV+纯净水1 BV洗脱除杂，接着用4 BV 60%乙醇洗脱收集洗脱液，然后再用8 BV 90%的乙醇以5.5 BV/h洗脱，接收洗脱液，每10毫升为1份，检测每份洗脱液中总生物碱的量分别为30.55、41.64、25.06、16.23、10.0、8.24、6.86 mg。结果显示，4 BV洗脱较合适。

综上所述，将洗脱体积定为60%乙醇4 BV+90%乙醇4 BV。

2.8 树脂再生方法及使用次数考察

树脂使用1次后，用纯净水及95%乙醇处理，进行了11次试验，测定每次总生物碱的吸附量，当总碱吸附量降低到最大吸附量的70%时，停止使用。考察结果表明：D141树脂每次使用后用95%乙醇冲洗除杂，使用7次后总生物碱的吸附量仍能达到最大吸附量的80%。该结果表明，虽然该树脂使用后颜色变深，但对下一步的使用影响不大。结论：D141树脂每次使用后用95%乙醇冲洗再生处理，至少能使用7次。

2.9 验证试验

按照上述确定的纯化延胡索总生物碱的工艺制备3批样品，测定总生物碱的和延胡索乙素的含量，总生物碱的转移率和出膏率。总生物碱的含量分别为82.3%、81.1%、82.7%，平均值为82.0%；延胡索乙素的含量分别为1.09%、1.21%、1.33%，平均值为1.21%；总生物碱的转移率分别为89.0%、88.0%、86.0%，平均值为87.7%；出膏率分别为1.81%、1.78%、1.73%，平均值为1.77%。由结果可以看出，该工艺比较稳定，重现性比较好。

3 讨论

在延胡索总生物碱的纯化研究工艺含量测定中，文献[4]报道采用延胡索乙素作为单一考察指标进行含量测定是不够全面的；文献[5-8]报道采用酸性染料比色法测定总生物碱，经过作者详细考察，此方法实验误差比较大，操作也比较烦琐，耗时较长，所得数据重复性不够理想。本文在研究紫外方法测量总碱时，发现由于色素等成分的干扰，使得直接测量有些偏差，采用中性氧化铝柱进行纯化则可有效地除去杂质，得到较纯净的生物总碱，再进行紫外法测定，结果较好。

在延胡索总生物碱纯化工艺研究中，对于除杂溶剂，作者进行了NaCl溶液加入顺序的考察：①样品溶液+NaCl溶液上样；②样品溶液上样后，NaCl溶液洗脱后，用纯净水洗脱；③树脂先用NaCl溶液饱和后，再上样；④样品溶液+NaCl溶液上样后，再用NaCl溶液洗脱+水洗脱。测定各洗脱液中总碱的量及延胡索乙素的量，结果为①②明显优于③④，但②最佳。

经过实验，确定大孔吸附树脂纯化延胡索总生物碱的纯化工艺为：选择D141大孔吸附树脂，上样液浓度0.35 g生药/mL，径高比1∶6，吸附流速4 BV/h，除杂溶剂和体积为0.3%NaCl溶液7 BV+纯净水1 BV，洗脱溶剂为4 BV60%乙醇+4 BV90%乙醇，洗脱流速为5.5 BV/h。该工艺合理、可行，适合工业生产。

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