ER－α36 和miR－143 介导胃癌细胞的侵袭*

邹 丰， 王绪明， 刘丽江△

(1江汉大学医学院病理学与病理生理学教研室，湖北 武汉430056;2武汉大学基础医学院，湖北 武汉430071)

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。流行病学发现，男性胃癌的人数明显多于女性胃癌，女性胃癌的发生时间要比男性晚10 ～15 年，且绝经期后发病率与男性基本相同，提示胃癌的发生与雌激素及其受体(estrogen receptor，ER)的作用有关［1］。ER 至少包括在细胞核或细胞膜表达的α 和β 2 个亚型。其中ER-α 除了参与细胞增殖、分化和凋亡外，也在冠心病及某些恶性肿瘤(如乳腺癌、结肠癌等)的发生中发挥重要作用［2］。本课题组前期研究发现，雌激素受体ER -α66 的同源异构体ER -α36 介导胃癌的生长［3］，其机制并不清楚。

MicroRNA 是近几年被证明的一类高度保守的内源性非蛋白编码的小分子单链RNA，长度约为20 ～25 nt。MicroRNA 的主要功能是通过对靶基因转录体的切割或对其翻译抑制来调控基因的表达［4］。有文献报道miR -143 在胃癌组织中的表达明显下调［5］，miR-143 与结肠癌的侵袭转移密切相关［6］。miR -143 与ER-α36 是否介导了胃癌的侵袭及其可能的机制并无文献报告，本项研究旨在探讨这一点。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 细胞 人胃癌细胞系SGC7901 由武汉科技大学同济医学院免疫学系惠赠，为本实验室保存。

1.2 主要试剂 17β -雌二醇(17β -estradiol，E2)和TRIzol 购自Sigma;ER -α36 沉默质粒、ER -α36过表达质粒和ER - α36 单克隆抗体均由美国Creighton 大学医学院癌症中心王兆一教授馈赠;actin 抗体购自Santa Cruz;Transwell 侵袭试剂盒购自Millipore;miR-143、内参照U6 的Taqman 引物和探针均购自Applied Biosystems。

2 方法

2.1 细胞培养 SGC7901 细胞接种在含10%小牛血清的RPMI -1640 培养基中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。每2 ～3 d 待细胞增长至约70 ～80%左右融合时胰酶消化传代。E2分为低浓度(1 ×10-10mol/L)和高浓度(5 ×10-6mol/L)组，处理细胞的时间为12 h。

2.2 Transwell 侵袭实验 SGC7901 细胞的侵袭实验采用试剂盒的方法:向侵袭小室(Transwell chamber)中加入制备好的密度为(0.5 ～1.0)×109/L 的无血清细胞悬液。将小室置于含10%胎牛血清培养基的24 孔板内培养24 h。用棉签轻轻刮除小室内未侵袭的细胞后，将小室底部置于试剂盒中的染色液里染色20 min。漂洗数次、风干。在显微镜下观察，细胞计数。

2.3 构建稳定转染低表达ER-α36 和高表达ERα36 的SGC7901 细胞系 按照王兆一教授提供的ER-α36 有效靶序列设计合成单链寡聚DNA 重组慢病毒ER -α36 沉默质粒(pLKO.1 - PURO - SP6-ER-α36 -L)和ER -α36 过表达质粒(pLJM1 -ER-α36 - H)。ER - α36 上游引物5'- CCGGTTGATGCCAATAGGTACTGAACTCGAGTTCAGTACCTATTGGCATCAATTTTTTG - 3'，下 游 引 物5' - AATTCAAAAAATTGATGCCAATAGGTACTGAACTCGAGTTCAGTACCTATTGGCATCAA-3'。经单链退火反应后获得双链寡聚物。将双链寡聚物连接到pLKO.1-PURO-SP6 载体(Age I/EcoR I)上，转化至大肠杆菌E.coli XL-blue 感受态细胞，挑取6 个单克隆进行PCR 鉴定。1%凝胶电泳检测，300 bp 条带为阳性克隆，2 kb 条带为阴性克隆。选取阳性克隆用Tiangen 小量抽提试剂盒抽提质粒，送上海英骏生物技术有限公司测序，U6 的引物为5'-TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG -3'。接着构建稳定转染细胞系:以Lipofectamine 2000TM细胞转染试剂盒将pLKO.1-PURO-SP6 - ER-α36 -L 和pLJM1 - ER-α36-H 转染给包装细胞293T 细胞，收集293T 细胞的病毒悬液并感染SGC7901 细胞，SGC7901 细胞长满后按1∶10传代，用嘌呤霉素筛选，最终得到pLKO.1-PURO-SP6 -ER -α36 -L(ER -α36 low group)和pLJM1 - ER-α36 -H(ER-α36 high group)的稳定细胞株。同时建立空载体转染SGC7901 细胞系pLKO.1 -PURO -scrambled shRNA(ER - α36 control group)。Western blotting 鉴定重组细胞ER-α36的表达。

2.4 Western blotting 检测 提取细胞胞浆总蛋白，按BCA 蛋白含量测定试剂盒说明进行蛋白定量，SDS-PAGE 后蛋白半干转印于PVDF 膜，封闭后I抗分开孵育:分别加入ER-α36 抗体和actin 抗体，4℃过夜;洗膜后孵育II 抗，室温1 h，洗膜后于暗室中行ECL 显色检测蛋白的表达，采用数码凝胶图像处理系统扫描测定ER-α36 和内参照actin 的表达(用平均吸光度值表示)。

2.5 MicroRNA 测序 2 株SGC7901 重组细胞系(ER-α36 low group 和ER-α36 high group)和对照组SGC7901 系(ER -α36 control group)送至深圳华大基因研究院进行microRNA 测序。

3 统计学处理

结 果

1 高浓度、低浓度E2 对SGC7901 细胞侵袭性和ER－α36 表达的影响

与对照组SGC7901 细胞(7901 control)相比，高浓度E2刺激下的SGC7901 细胞(7901 +low E2)的侵袭性明显减弱，而低浓度E2刺激下的SGC7901 细胞(7901 + high E2)的侵袭性明显增强，见图1。Western blotting 结果显示，高浓度E2刺激SGC7901细胞后，ER - α36 的蛋白表达要明显低于对照组SGC7901 细胞组，但这种效应在低浓度E2刺激后则为相反，见图2。

2 稳定转染低表达ER－α36 和高表达ER－α36 的SGC7901 细胞系的构建

对构建好的2 株重组细胞系进行Western blotting 检测结果显示，高表达ER -α36 的SGC7901 细胞组(ER-α36 high)，其ER -α36 蛋白表达要明显高于对照的SGC7901 细胞组(ER -α36 control)，低表达ER-α36 的SGC7901 细胞组(ER-α36 low)的ER-α36 蛋白表达要明显低于对照组SGC7901 细胞组(ER-α36 control)，提示重组细胞系构建成功，见图3。

Figure 1. The changes of the invasion ability of SGC7901 cells treated with high or low concentration of 17β-estradiol (×10).图1 低浓度、高浓度E2 刺激胃癌SGC7901 细胞后侵袭能力的变化

Figure 2. The expression of ER-α36 in SGC7901 cells treated with high or low concentration of 17β-estradiol. ±s.n=5. * P ＜0.05 vs 7901 control group.图2 高浓度、低浓度E2 刺激胃癌SGC7901 细胞后ER－α36 蛋白的表达

Figure 3. The SGC7901 cells with stable low expression and high expression of ER-α36 were successfully constructed. ±s.n=5.* P ＜0.05 vs ER-α36 control group.图3 低表达ER－α36 和高表达ER－α36 的SGC7901 胃癌细胞株构建成功

3 ER－α36 对SGC7901 细胞侵袭的影响

与普通SGC7901 细胞组(ER - α36 control)相比，高表达ER -α36 的SGC7901 细胞组(ER -α36 high)侵袭细胞数量明显增多，而低表达ER-α36 的SGC7901 细胞组(ER -α36 low)侵袭细胞数量明显减少，见图4。这提示ER -α36 的表达与肿瘤的侵袭呈正相关。

Figure 4. The changes of the invasion ability of SGC7901 cells with stable low expression and high expression of ER-α36 (×10).图4 低表达ER－α36 和高表达ER－α36 的胃癌SGC7901 细胞侵袭能力的变化

4 miR－143 表达与ER－α36 表达的关系

与普通SGC7901 细胞(ER -α36 control group)相比，高表达ER -α36 的SGC7901 细胞(ER -α36 high group)miR -143 表达显著下调，低表达ER -α36 的SGC7901 细胞(ER - α36 low group)miR -143 表达则显著上调，见图5。

Figure 5. The expression of miR-143 was significantly decreased in the SGC7901 cells with stable high expression of ER-α36 and was increased in the SGC7901 cells with stable low expression of ER-α36. ＊＊P ＜0.01 vs ER-α36 control group.图5 miR－143 在不同ER－α36 表达的胃癌细胞系中的表达

讨 论

ER 在胃癌中的作用机制研究可以追溯到上个世纪，但一直未取得突破性的进展。1986 年首次发现ER 在胃癌细胞中表达，其阳性率约50%，尤以ER - α66 的阳性表达受到重视［7］。近年的研究发现，ER - α 至少包括ER - α66、ER - α46 和ER -α36［8］，其中ER-α46 和ER -α36 的主要功能作用并不清楚。但有研究证实，ER -α36 的表达不完全依赖于ER-α66，并可经细胞膜启动雌激素类信号转导［9-10］。

我们的前期研究工作发现:人胃癌细胞系(BGC-823、AGS、MKN -45 和SGC -7901)均能在mRNA、蛋白质及细胞内定位的不同层面表达ER -α36蛋白，并且对雌激素、选择性雌激素受体调节剂(tamoxifen)以及雌激素受体特异性阻断剂(ICI 182780)产生应答;ER-α36 蛋白在人体胃癌组织中也呈高表达［3］。本研究通过用高剂量或低剂量的17β-雌二醇刺激SGC7901 人胃癌细胞，以模拟绝经前女性或男性的雌激素环境，结果发现低剂量的17β-雌二醇可以增加ER - α36 蛋白的表达，增强SGC7901 细胞的侵袭能力，而高剂量的17β-雌二醇刺激细胞后的效应相反。因此，为解释绝经前女性的胃癌发病率明显低于男性的临床现象提供了一定的实验证据，也为从理论上阐述高雌激素的保护作用提供了支持，而高雌激素的保护主要是通过ER -α36 介导的，并且与胃癌的生长和侵袭密切相关。

现阶段大量文献报道，microRNA 在肿瘤发生和发展中的功能大概类似于癌基因或抑癌基因，几乎参与了肿瘤发生和发展的每一步过程，因此在肿瘤诊断、治疗等方面具有很好的应用前景［11］。miR -143 位于人类基因组5 号染色体上，现阶段已证实与多种肿瘤存在联系。miR -143 在不同肿瘤中表达并不完全一致:在肝癌中高表达［12］，在结肠癌或肺癌中低表达［13-14］，并且与结肠癌转移相关基因1 以及结肠癌的侵袭转移密切相关［6］。有研究显示，miR-143 在胃癌组织中的表达明显下调，并在区分胃癌的分化度方面有较好的敏感性和特异性［5］。但与胃癌转移的关系如何，未见报道。我们通过测序的方法发现，与ER-α36 表达密切相关的microRNA 是miR-143，即高表达ER -α36 的SGC7901 细胞miR -143 表达显著下调，而低表达ER -α36 的SGC7901细胞miR -143 表达显著上调。因此，我们推测ER-α36 介导胃癌的侵袭有可能受到miR -143 的调控。但miR-143 调控ER -α36 的表达以及还有哪些相关靶基因参与胃癌侵袭的过程，还需进一步研究证实。

综上所述，本研究结果显示:低浓度的雌激素促进胃癌细胞的侵袭，高浓度的雌激素抑制胃癌细胞的侵袭。胃癌的侵袭能力和雌激素受体ER - α36的表达呈正相关，其机制可能与miR-143 的调控有关。

［1］ Sipponen P，Correa P. Delayed rise in incidence of gastric Cancer in females results in unique sex ratio (M/F)pattern:etiologic hypothesis［J］. Gastric Cancer，2002，5(4):213 –219.

［2］ Pedram A，Razandi M，Levin ER. Nature of functional estrogen receptors at the plasma membrane［J］. Mol Endocrinol，2006，20(9):1996 -2009.

［3］ Deng H，Huang X，Fan J，et al. A variant of estrogen receptor，ER - α36 is expressed in human gastric cancer and is highly correlated with lymph node metastasis［J］.Oncol Rep，2010，24(1):171 -176.

［4］ Lee Y，Kim M，Han J，et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II［J］. EMBO J，2004，23(20):4051 -4060.

［5］ 林巧爱，李玲玲，巩文辞，等. miR-143 在胃癌中的表达及其临床病理意义［J］. 中国病理生理杂志，2010，26(9):1674 -1678.

［6］ Zhang Y，Wang Z，Chen M，et al. MicroRNA-143 targets MACC1 to inhibit cell invasion and migration in colorectal cancer［J］. Mol Cancer，2012，11:23.

［7］ Tokunaga A，Nishi K，Matsukura N，et al. Estrogen and progesterone receptors in gastric cancer ［J］. Cancer，1986，57(7):1376 -1379.

［8］ Karat D，Brotherick I，Shenton BK，et al. Expression of oestrogen and progesterone receptors in gastric cancer:a flow cytometric study［J］. Br J Cancer，1999，80(8):1271 -1274.

［9］ Wang Z，Zhang X，Shen P，et al. Identification，cloning，and expression of human estrogen receptor -α36，a novel variant of human estrogen receptor - α66［J］. Biochem Biophys Res Commun，2005，336(4):1023 -1027.

［10］ Wang Z，Zhang X，Shen P，et al. A variant of estrogen receptor-α，hER -α36:transduction of estrogen - and antiestrogen - dependent membrane - initiated mitogenic signaling［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103(24):9063 -9068.

［11］ Volinia S，Calin GA，Liu CG，et al. A microRNA expression signature of human solid tumor defines cancer gene target［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103(7):2257 -2261.

［12］ Zhang X，Liu S，Hu T，et al. Up -regulated microRNA-143 transcribed by nuclear factor kappa B enhances hepatocarcinoma metastasis by repressing fibronectin expression［J］. Hepatology，2009，50(2):490 -499.

［13］ Kulda V，Pesta M，Topolcan O，et al. Relevance of miR-21 and miR-143 expression in tissue samples of colorectal carcinoma and its liver metastases［J］. Cancer Genet Cytogenet，2010，200(2):154 -160.

［14］ Gao W，Yu Y，Cao H，et al. Deregulated expression of miR-21，miR -143 and miR -181a in non small cell lung cancer is related to clinicopathologic characteristics or patient prognosis［J］. Biomed Pharmacother，2010，64(6):399 -408.