CADM1过表达对人胃癌MKN－45细胞增殖和侵袭的影响及其分子机制*

郭晓鹤， 张彩凤△， 夏永华， 李贞娟， 周慧聪， 韩 宇

(新乡医学院第一附属医院1消化科，2皮肤科，河南 新乡453100)

细胞黏附分子1(cell adhesion molecule 1，CADM1)，称为肺癌肿瘤抑制物1(tumor suppressor in lung cancer 1，TSLC1)，已经在非小细胞肺癌中被鉴定，其基因定位于人类染色体11q23.2［1－2］。CADM1 基因编码 442 个氨基酸，属于免疫球蛋白超家族，结构上与神经细胞黏附分子具有高度的同源性，主要牵涉到钙离子非依赖的细胞－细胞间的黏附和信号转导［3－4］。最近，大量研究显示，CADM1在一系列人类肿瘤组织和细胞系中呈低表达或缺失，包括食管癌［5］、宫颈癌［6］、肝癌［7］、卵巢癌［8］、乳腺癌等［9］，然而在胃癌中尚未见相关的研究报道。因此在本研究中，我们分析不同胃癌细胞系中CADM1蛋白的表达，并构建pcDNA－CADM1真核表达载体，转染胃癌细胞并筛选和鉴定稳定细胞株，接着研究CADM1过表达对细胞增殖和细胞侵袭的影响，并初步研究其可能的分子机制，该研究旨在为以CADM1为靶点的胃癌基因治疗提供理论依据。

材料和方法

1 材料

人胃癌细胞MKN－28(高分化)、SGC－7901(中分化)和MKN－45(低分化)均购自中科院上海细胞所。真核表达载体pcDNA3.1(+)载体、脂质体2000和Trizol试剂均购自Invitrogen;PCR Mix购自北京天根生化科技有限公司;T4 DNA连接酶、限制性内切酶EcoR I和Xho I以及细胞裂解液均购自宝生物工程(大连)有限公司;cDNA第1链合成试剂盒购自上海生工生物工程有限公司;RPMI－1640、DMEM培养液和胰蛋白酶均购自Gibco;胎牛血清购自杭州四季青公司;CCK－8试剂购自中国碧云天生物技术有限公司;抗体CADM1、p21、基质金属蛋白酶 2(matrix metalloproteinase 2，MMP－2)、MMP－9和β－actin均购自 Santa Cruz。

2 方法

2.1 细胞培养及转染 胃癌细胞株MKN－28和SGC－7901均培养在含10%胎牛血清的RPMI－1640培养液中，MKN－45培养在含10%胎牛血清的DMEM培养液中，细胞均置于37℃、5%CO2的孵箱中生长。

2.2 pcDNA－CADM1真核表达载体的构建 从SGC－7901细胞中采用Trizol提取总RNA，然后反转录成cDNA，以该cDNA为模板，CADM1上游引物 5’－CCGGAATTCATGGCGAGTGTAGTGCTGCC－3’(EcoR I)下游引物 5’－CCGCTCGAGCTAGATGAAGTACTCTTTC－3'(Xho I)，产物大小1 329 bp。PCR扩增条件为:94℃预变性10 min，然后94℃ 40 s，56℃ 1 min，72℃ 1 min，30个循环，最后72℃延伸6 min。接着将CADM1片段和载体均分别采用EcoR I和Xho I进行双酶切，然后在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，接着转化、挑克隆、提质粒，酶切鉴定。

2.3 pcDNA3.1和 pcDNA－CADM1转染 当 MKN－45细胞达到90%左右融合时，利用脂质体2000将pcDNA3.1和pcDNA－CADM1转染MKN－45细胞，细胞分为3组:未处理组(未进行转染的MKN－45细胞)、pcDNA3.1组(转染空载体pcDNA3.1的MKN－45细胞)和pcDNA－CADM1组(转染pcDNA－CADM1的MKN－45细胞)，转染后采用600 mg/L G418进行筛选，当出现明显的克隆后，对照细胞全部死亡时进行传代直至获得稳定细胞株，最后采用400 mg/L的G418维持培养。

2.4 细胞增殖分析 3组MKN－45细胞分别在96孔板上接种 1 000 cells/well，测定其培养 0、24、48、72、96 及 120 h 时的增殖情况，每个样品接种5个复孔，在测定细胞增殖时，加入10%CCK－8试剂，于37℃培养箱中继续孵育2 h，然后于酶标仪上测定450 nm的吸光度。

2.5 Boyden chamber体外侵袭能力的检测 将3组MKN－45细胞分别培养至大约105个细胞时，分别悬浮在含有0.2%胎牛血清的800 μL培养液中，然后依次接种至Boyden chamber的上层，培养6 h。收集迁移到滤膜下层的细胞，用甲醇固定，并通过HE染色观察下层细胞的数量，最后通过计算滤膜下层的细胞数来评估其转移的细胞数量(30个视野，×200)。

2.6 Western blotting 收集 MKN －28、SGC－7901和 MKN－45细胞以及不同处理的MKN－45细胞，采用细胞裂解液提取总蛋白，接着进行SDS－PAGE电泳，然后将凝胶上的蛋白电转移到硝酸纤维素(NC)膜上。用含5%脱脂奶粉的TBST液封闭 NC 膜 2 h，加入Ⅰ抗(CADM1、p21、MMP－2、MMP－9和β－actin，均1∶200)，4℃ 摇床孵育过夜。加入Ⅱ抗室温孵育2 h。将NC膜置于ECL(增强化学发光试剂)中反应1～3 min，于暗室中利用X射线曝光，常规方法显影定影，显示特异的蛋白信号。蛋白表达的灰度值利用Image－Pro Plus 5.0软件进行分析，蛋白相对表达为目的基因与内参基因的比值，β－actin作为内参照。

3 统计学处理

采用SPSS 13.0软件分析，数据以均数±标准差(¯x±s)表示，3组之间比较采用单因素方差分析(One－way ANOVA)，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 3种胃癌细胞株中CADM1蛋白的表达

Western blotting结果显示，低分化的MKN－45细胞中CADM1蛋白的表达水平明显低于中分化的SGC－7901细胞和高分化的MKN－28细胞(P＜0.05)，而中分化的SGC－7901细胞中CADM1蛋白的表达水平与高分化的MKN－28细胞之间无显著差异(P＞0.05)，见图1，因此在下面的实验中采用CADM1蛋白表达水平最低的MKN－45进行研究。

Figure 1.Expression of CADM1 protein in three gastric carcinoma cell lines.¯x±s.n=3.*P＜0.05 vs MKN－28 or SGC －7901 cells.图1 3种胃癌细胞株中CADM1蛋白的表达

2 真核表达载体的构建及稳定表达CADM1细胞株的鉴定

采用PCR扩增CADM1基因，结果表明，CADM1全长cDNA片段被成功获得，见图2A。我们进一步将片段和pcDNA3.1空载体均采用EcoR I和Xho I进行双酶切，连接，转化，挑克隆、提取质粒并进行酶切鉴定，酶切结果表明获得了预期的载体带和目的条带，表明真核表达载体pcDNACADM1成功构建，见图2B。将所构建的真核表达载体pcDNA－CADM1和空载体pcDNA3.1转染MKN－45细胞，获取稳定细胞株后，采用 Western blotting进行鉴定，结果表明pcDNA－CADM1组中CADM1蛋白表达显著高于pcDNA3.1组和未处理组(P＜0.05)，而未处理组和pcDNA3.1组之间CADM1蛋白表达无显著差异(P＞0.05)，见图3。

Figure 2.Construction of eukaryotic expression vector pcDNACADM1.A:PCR amplication of CADM1 gene.1:PCR product;M:GeneRuler DNA Ladder Mix.B:identification of eukaryotic expression vector pcDNACADM1.1:pcDNA －CADM1 digested with double enzymes EcoR I and Xho I;M:GeneRuler DNA Ladder Mix.图2 pcDNA－CADM1真核表达载体的构建

Figure 3.Identification of MKN－45 cells stably overexpressing CADM1.图3 过表达CADM1的MKN－45稳定细胞株的鉴定

3 CADM1过表达抑制MKN－45细胞的增殖

与未处理组和pcDNA3.1组相比，pcDNA－CADM1组在培养后的各时点，MKN－45细胞的增殖均明显受到抑制，且差异有统计学意义(P＜0.05);未处理组和pcDNA3.1组在培养的各时点，MKN－45细胞的增殖无显著差异(P＞0.05)，见图4。

Figure 4.Effect of overexpression of CADM1 on proliferation of MKN－45 cells.¯x±s.n=3.*P＜0.05 vs non－treatment or pcDNA3.1.图4 CADM1过表达对MKN－45细胞增殖的影响

4 CADM1过表达对MKN－45细胞侵袭的影响

与未处理组(101.53 ±6.89)和 pcDNA3.1 组(98.77 ±7.03)相比，pcDNA－CADM1组中MKN－45细胞穿过Matrigel的细胞数(52.35±3.89)显著减少(P＜0.05)，未处理组和pcDNA3.1组中MKN－45细胞穿过Matrigel的细胞数无显著差异(P＞0.05)。

5 CADM1过表达对MKN－45细胞中增殖和侵袭相关蛋白表达的影响

与未处理组和pcDNA3.1组相比，pcDNA－CADM1组中p21蛋白表达显著升高，而MMP－2和MMP－9蛋白表达显著下调，差异均有统计学意义(P＜0.05)，而未处理组和pcDNA3.1组中上述各蛋白表达无显著差异(P＞0.05)，见图5。

讨 论

越来越多的研究表明，CADM1在多种不同肿瘤中均作为肿瘤抑制物而发挥作用［6，9－13］。目前在许多肿瘤中发现CADM1表达的缺失或降低，并证实其牵涉到许多肿瘤的进展和转移［2，14－16］。Takahashi等［17］研究表明，67 例原发性乳腺癌中具有异常的CADM1表达。Chen等［18］发现8个结肠癌中有7个出现CADM1的低表达，而54例原发性结肠癌中有39例出现CADM1的低表达。本研究中，我们选择3种分化程度不同的胃癌细胞株，利用Western blotting检测3种细胞中CADM1蛋白的表达，结果表明，3种胃癌细胞中均明显出现CADM1蛋白表达，随着分化程度降低，CADM1蛋白表达水平也显著下调，即低分化的MKN－45细胞中CADM1蛋白的相对表达水平显著低于中分化的SGC－7901细胞和高分化的MKN－28细胞，提示CADM1的表达与胃癌细胞的发生发展密切相关。

Figure 5.Expression of p21，MMP－2 and MMP－9 proteins in MKN－45 cells with different treatments.¯x±s.n=3.*P ＜0.05 vs non －treatment or pcDNA3.1.图5 p21、MMP－2和MMP－9在不同处理的MKN－45细胞中的表达

为了进一步研究CADM1在胃癌细胞中的功能，我们构建CADM1的真核表达载体 pcDNA－CADM1，将其转染到CADM1表达水平最低的MKN－45细胞株中，筛选稳定表达CADM1的胃癌细胞株，进一步采用Western blotting鉴定，结果显示，筛选到的稳定表达CADM1的MKN－45细胞中其CADM1蛋白表达水平显著高于未处理组和pcDNA3.1组(P＜0.05)，提示pcDNA－CADM1真核表达载体的引入能明显上调MKN－45细胞中CADM1蛋白表达水平，这也为后续进一步研究CADM1的功能提供理想的研究平台。

研究显示，CADM1是细胞增殖和细胞侵袭的关键调控因子［19－20］。Mao等［21］研究发现 CADM1 过表达可抑制A549 细胞增殖和诱导细胞凋亡，并抑制A549皮下接种的肿瘤至70% ～80%的程度。此外，Lung等［11］的研究表明CADM1在有转移性淋巴结的鼻咽癌中表达下调或缺失的频率为83%，显著高于原发性鼻咽癌的12%(P＜0.05)，提示CADM1与侵袭转移密切相关。是否上调胃癌MKN－45细胞中CADM1蛋白的表达能改变胃癌细胞增殖和侵袭能力?因此，在本研究中，我们采用CCK－8研究3组MKN－45细胞中细胞增殖的变化，结果显示与未处理组和pcDNA3.1组相比，pcDNACADM1组在培养后的各时点，MKN－45细胞的增殖均明显受到抑制(P＜0.05)。此外，我们还利用Boyden小室体外迁移实验检测3组胃癌细胞的迁移能力，结果发现pcDNACADM1组中MKN－45细胞迁移到matrigel的细胞数明显低于未处理组和pcDNA3.1组(P＜0.05)，上述研究结果提示CADM1的过表达能明显抑制胃癌MKN－45细胞的增殖和降低其迁移能力，但其分子机制有待进一步探讨。

研究表明，p21与肿瘤细胞的增殖密切相关，其在肿瘤细胞中能明显传递抗增殖信号［22］。而2种主要的金属基质蛋白酶MMP－2和MMP－9与许多肿瘤的恶性程度有关，主要由于其独特的降解IV型胶原能力，这也是基底膜的主要构成成份［23］，提示其表达水平的高低与肿瘤的侵袭和转移能力密切相关。因此，为了初步了解CADM1介导胃癌细胞增殖抑制和侵袭能力降低的可能分子机制，我们采用Western blotting分析了3组MKN－45胃癌细胞中p21、MMP－2和MMP－9蛋白的表达，发现pcDNA－CADM1组中p21蛋白表达水平显著上调，而MMP－2和MMP－9蛋白表达水平显著下调(P＜0.05)，表明CADM1介导胃癌细胞增殖抑制和侵袭能力降低可能与p21蛋白表达水平的升高以及MMP－2和MMP－9蛋白表达水平的降低密切相关。

总之，本研究结果显示，CADM1的过表达能明显抑制胃癌细胞的增殖和侵袭能力，其变化可能与p21、MMP－2和MMP－9蛋白表达的变化密切相关。进一步研究CADM1在胃癌中的功能有望为以CADM1为靶点的胃癌基因治疗提供理论依据。

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