桑麻合剂提取纯化工艺研究

邱建永 王洛临 李智勇 张建军 许曼娇

1.广东省第二中医院药剂科，广东广州 510095；2.广东省中医研究所制剂研究室，广东广州 510095；3.广东省第二中医院检验科，广东广州 510095

桑麻合剂是广东省第二医院研制的医院制剂，由桑白皮、紫菀、甘草等12味药组成，具有清热宣肺、化痰止咳的功效，主要用于风热咳嗽症状。临床上以汤剂煎服，疗效确切。黄酮类成分为方中多味药材的主要药效成分之一[1-2]，因此，本研究选用总黄酮含量和干浸膏得量作为评价指标，采用正交设计法和单因素优选法，分别优选其提取工艺和纯化工艺，以便更好地发挥该制剂的疗效。

1 仪器与试药

UV22501PC型可见分光光度计（岛津），Bp211D电子分析天平（德国，sartorius）。芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100080-200306）。桑麻合剂所用药材均由广东广弘药业有限公司购得，经毕晓黎副主任中药师鉴定为正品；所用化学试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 提取工艺优选

2.1.1 正交试验设计

根据预试验结果，选择影响提取因素的料液比、提取时间、提取次数，进行优选，其因素水平设计见表1。

表1 因素水平表

2.1.2 供试品溶液的制备

按处方比例，称取桑白皮、紫菀、甘草等12味药材共9份，每份136.6 g，按正交试验设计表L9（34）安排，分别提取，过滤，滤液分别浓缩并定容至200 mL。测定干浸膏含量和总黄酮含量。

2.1.3 干膏含量的测定

精密吸取各样品浓缩液25 mL，置已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，照干燥失重测定法（《中国药典》2010年版一部附录ⅨG）测定，计算干膏得量。

2.1.4 总黄酮含量测定[4]

2.1.4.1 芦丁对照品溶液的制备 精密称取6 mg芦丁，精密称定，加95%乙醇定容至50 mL，得0.12 mg/mL的芦丁标准对照液。

2.1.4.2 测定波长的确定 精密移取芦丁对照溶液10 mL置25 mL容量瓶中，振荡摇匀后，加入5%亚硝酸钠1 mL，摇匀静置6 min，再加入10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀静置6 min，再加4.3%氢氧化钠10 mL，摇匀后，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀放置15 min，以95%乙醇调零，从400 nm至600 nm进行全波长扫描，测得503 nm处有最大吸收，因此，以503 nm为测定波长。

2.1.4.3 标准曲线的制备[4] 精密吸取上述对照品溶液2、4、6、8、10 mL至25 mL容量瓶，分别加蒸馏水稀释至10 mL，振荡摇匀后，自“加入5%亚硝酸钠1 mL”起，同测定波长的确定法操作，以试剂作空白，于503 nm下测定吸光值，以吸光度值（A）为纵坐标，芦丁质量浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：C=0.078 5A-0.000 3（r=0.998 7）。结果表明芦丁对照品在0.009 6～0.096 0 mg/mL呈线性关系。

2.1.4.4 供试品溶液的制备与测定 精密吸取提取液2 mL，加蒸馏水定容至50 mL，摇匀，精密吸取稀释液1 mL，置25 mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至10 mL，按上述方法操作显色，计算总黄酮含量。

2.1.4.5 精密度试验 精密吸取芦丁对照品溶液0.6mL，置10 mL的量瓶中，按上述方法操作显色，平行测定6次，结果RSD=0.27%，表明精密度良好。

2.1.4.6 稳定性试验 精密吸取上述供试品溶液0.6 mL，置10 mL的量瓶中，按上述方法操作显色，分别放置0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 min，测定各时间点的吸光度，结果RSD=1.79%，表明供试品溶液在90 min内稳定。

2.1.4.7 重复性试验 精密吸取供试品溶液各0.6 mL，置10 mL量瓶中，按上述方法操作显色，测定吸光度，结果RSD=2.31%，表明重复性良好。

2.1.4.8 加样回收率测定 精密称取已知黄酮含量的供试品5份，分别加入芦丁对照品适量，按上述方法操作显色，测定吸光度，计算回收率为98.9%，RSD=0.91%。说明该方法测定结果准确。

2.1.5 数据处理与工艺优选

用综合加权评分法，以干浸膏得量和总黄酮含量的9次试验的最大值为100分，将各指标成分的总量分别转换为评分值，总固体得量的加权系数为0.4，总黄酮含量的加权系数为0.6，将每次试验的各指标成分的评分值乘以相应的加权系数后求和，得综合评分值，以综合评分值计算正交试验结果，并进行方差分析，结果见表2、3。

表2 正交试验结果表

表3 方差分析表

结果表明：由直观分析可知因素主次为提取次数（C）＞液料比（A）＞提取时间（B）。方差分析表明，因素A和因素C对试验结果有显著影响，因素B对试验结果无影响。因此，提取工艺条件定为：处方药材加水提取3次，每次加8倍量水，提取1.0 h，即A2B1C3。

2.1.6 提取工艺验证

按处方比例，称取药材3份，每份136.6 g，按正交试验结果的最佳工艺条件重复试验3次，结果表明：干浸膏得量分别 为：34.80、34.51、33.09 g，总 黄 酮 含 量 为2.254、2.268、2.205 g，平均综合评分值为96.020。与正交试验最大综合评分值接近，提示优选的工艺稳定。

2.2 纯化工艺优选

2.2.1 药液含醇量的确定

取按上述提取条件制备的浸膏（浸膏-药材比为1∶1）3份，每份273.2，分别加乙醇至表4所示药液含醇量，冷藏静置24 h，取滤过，滤液回收乙醇，并定容至200 mL。分别照上述方法测定滤液固形物含量和总黄酮含量，剩余滤液回流煮沸30 min，冷藏放置24 h，观察药液澄明度，结果见表4。

表4 药液含醇量对纯化的影响

结果表明：纯化药液含醇量为70%，可满足本品制成合剂的要求。

2.2.2 浓缩液相对密度的确定

取按上述提取条件制备的浸膏（浸膏-药材比为1∶1）4份，每份273.2 g，分别浓缩并加水调整至表5所示浓缩比，混匀，用密度计测定60℃时浓缩液的相对密度，浓缩液分别加乙醇至药液含醇量70%，冷藏24 h，滤过，滤液回收乙醇并定容至200 mL，测定各浓缩液中总黄酮含量，结果见表5。

表5 药液浓缩比对纯化的影响

结果表明：浓缩至相对密度为1.05～1.10（60℃）比较合理。

3 讨论

由于部分黄酮类成分具有易溶于乙醇和热水的特点，在含量测定过程中，浓缩液出现沉淀应充分摇匀后迅速取样，否则易造成测定结果的偏差。

中药复方药效成分复杂，作用靶点尚不清晰，因此，本制剂选择用水提取的工艺，更符合原汤剂合煎有效的特点。提取工艺筛选以总黄酮含量和干浸膏得量为评价指标进行综合评分，鉴于总黄酮含量比干浸膏得量能更好地反映药物提取情况，故在设计权重系数时，总黄酮含量权重系数较大，二者的权重系数设计为6∶4，这样相对合理些。经正交试验验证结果表明，优选的提取工艺参数稳定，可行。

本制剂纯化工艺采用了传统的乙醇沉淀工艺，试验分别对药液含醇量和浓缩液的相对密度两个重要的影响因素进行筛选，经稳定性考察，优选出的最佳醇沉工艺稳定，可满足本合剂对澄明度的要求。

[1]杨乐，陈泣.桑白皮研究进展[J].江西中医学院学报，2007，19（3）：98-100.

[2]侯海燕，陈立，董俊兴.紫菀化学成分及药理活性研究进展[J].中国药学杂志，2006，41（3）：161-163.

[3]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：附录Ⅵ30.

[4]刘齐林，李雪婷，王沛，等.正交设计优选痛风宁的最佳提取工艺[J].辽宁中医杂志，2011，38（5）：959-960.

[5]于村，俞莎，沈向红.中草药总黄酮的提取和含量测定[J].浙江预防医学，2002，14（7）：81-82.