黑大蒜和鲜大蒜提取物对小鼠细胞免疫功能影响的比较

张 鑫 陈浏丹 侯 颖 王大南 王 欢 吕昌龙

1.中国医科大学基础医学院免疫教研室，辽宁沈阳 110001；2.辽宁省肿瘤医院检验科，辽宁沈阳 110042

大蒜含有丰富的营养成分和药理活性成分。药理和临床证实大蒜有抗菌消炎、杀虫、抗癌、降血压、降血脂、降血糖、预防动脉粥样硬化、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节功能等作用[1-2]，其中最重要的有效成分是大蒜素[3]。

近年来日本学者在控制湿度和温度的情况下，普通的鲜大蒜（白色）可以经过处理转化为黑大蒜。黑大蒜去除了大蒜的异味，带有甜味，口感好，无需再经处理即可直接食用。但黑大蒜在上述功能方面是否优于鲜大蒜，目前尚不清楚。已有研究报道黑大蒜较鲜大蒜含有更多的氨基酸、有机硫和S-烯丙基-L-半胱氨酸[4]。笔者前期研究已证明黑大蒜提取物对免疫功能有促进作用[5]。本文则就黑大蒜提取物和鲜大蒜提取物对免疫功能的影响进行了比较研究，可为黑大蒜的实际应用进一步提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

C57/BL-6小鼠6～7周，雌性，体重18～22 g，75只，购买于上海斯莱克实验动物有限公司（实验动物使用许可号：SCXK（沪）2007-0005）。

1.2 主要试剂

RPMI 1640（Thermo），LDH底物（NBT购自Sigma公司，NAD购自中国科学院生物研究所，乳酸钠购自上海试剂三厂，PMS购自Fluka公司），NP-40（Fluka公司），Griess反应液（Wako），IL-4，IL-17（EB），IL-2，IFN-γ和TNF-αELISA kit（R&D）。

1.3 黑大蒜和鲜大蒜提取物溶液的制备

1.3.1 黑大蒜提取物溶液的制备 黑大蒜粉由日本弘前大学佐佐木甚一教授提供。黑大蒜提取物按文献[2]的方法制备，即取一定量的黑大蒜粉加适量的无热源蒸馏水，100℃，煮沸2 h，自然冷却后4层纱布过滤，滤过液于4 000 r/min离心30 min，取上清，经冷冻干燥后即为黑大蒜提取物。临用时用生理盐水配成1 mg/mL溶液。

1.3.2 鲜大蒜提取物溶液的制备 制备方法与黑大蒜提取物溶液相同。取新鲜鲜大蒜去皮，研磨成蒜泥，低温干燥成粉。再按上述方法加热提取、冷冻干燥，再用生理盐水配制成1 mg/mL鲜大蒜提取物溶液。

1.4 动物分组与处理

将上述75只C57/BL-6小鼠随机分为15组，每组5只，第1～7组为黑大蒜组，第8～14组为鲜大蒜组，第15组为正常对照组。正常对照组每天腹腔注射0.1 mL生理盐水，第1～7组每天腹腔注射黑大蒜提取物溶液0.1mL，第8～14组每天腹腔注射鲜大蒜提取物溶液0.1 mL。连续注射5 d，于末次注射后的第1～7天，从第1和第8组开始，每天处死两组（黑大蒜和鲜大蒜处理的各一组）小鼠，第15组小鼠于末次注射后第7天处死。

1.5 样品的采集

常规无菌取脾，制备脾细胞悬液，调整细胞浓度至1×107/mL，一部分用于NK细胞杀伤活性的检测，另一部分细胞悬液接种于24孔细胞培养板中，每个样品设3个复孔，每孔接种0.5 mL，37℃，5% CO2温箱中培养48 h。收集上清液用于NO，IL-2，IL-4，IL-17，IFN-γ和TNF-α分泌水平的测定。

1.6 NK细胞杀伤活性的测定

采用LDH释放法检测NK细胞杀伤活性[6]。

1.6.1 靶细胞的制备 取24～48 h培养的生长旺盛的Yac-1细胞作为靶细胞，用PBS洗涤3次，1 000 r/min离心6 min，弃上清，用10% FBS-RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×105/mL备用。

1.6.2 效应细胞制备 上述制备脾细胞悬液（1×107/mL）为待测的效应细胞。

1.6.3 NK细胞活性测定 取96孔细胞培养板，每孔加靶细胞悬液0.1 mL，实验组每孔加效应细胞悬液0.1 mL，自然释放组每孔加RPMI-1640液0.1 mL代替效应细胞，最大释放组每孔加0.1 mL 1%NP-40于靶细胞中，置5%CO2，37℃培养箱培养2 h，每孔加0.05 mL细胞培养液，1 500 r/min离心10 min，每孔取上清0.1 mL加LDH底物混合液0.1 mL作用20 min，每孔加入30μL终止液，490 nm滤光片测OD（吸光度）值，计算NK活性。NK细胞活性（%）=（实验组OD值-自然释放对照组OD值）/（最大释放对照组OD值-自然释放对照组OD值）×100%。

1.7 脾细胞培养液上清中NO水平的测定

采用Griess方法测定NO水平[7]。

1.7.1 第一步 脾细胞培养上清加入96孔培养板中，0.1 mL/孔，每个样品设2个复孔。

1.7.2 第二步 将100μmmol/L NaNO2溶液倍比稀释为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5μmmol/L等7个浓度，作为参考标准品用于定量测定。

1.7.3 第三步 每孔100μL Griess试剂，室温10 min，酶标仪550 nm处测量OD值。

1.7.4 第四步 以标准品测得OD值绘制标准曲线，计算各样品的NO2-含量。

1.8 脾细胞培养上清中IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-17含量测定

用双抗体夹心ELISA法按照ELISA试剂盒说明书进行操作，分别检测脾细胞培养上清中IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-17和IL-4的含 量，酶标 仪 检测450 nm处OD值。应用SoftMax Pro4.3.1 LS软件分析，绘制标准曲线，计算细胞因子含量（pg/mL）。

1.9 统计学方法

采用统计软件SPSS for windows 16.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差表示，采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NK细胞杀伤活性的检测结果

在连续5 d给予小鼠腹腔注射黑大蒜提取物与鲜大蒜提取物后，与正常对照组[（2.81±0.21）%]比较，黑大蒜和鲜大蒜处理后3～5 d NK细胞杀伤活性均显著高于正常对照组；黑大蒜处理后第4天NK细胞杀伤活性最高，达（9.87±0.50）%，随后逐渐下降；鲜大蒜组于处理后的第5天NK细胞杀伤活性最高，为（4.91±0.24）%。黑大蒜组处理后第4天和第5天均显著高于鲜大蒜组（P<0.001或P<0.01）。见图1。

图1 黑大蒜组与鲜大蒜组小鼠NK细胞杀伤活性的比较

2.2 脾细胞培养上清中NO产生的检测结果

与正常对照组（9.20±0.42）μmmol/L比较，黑大蒜组和鲜大蒜组于大蒜提取物处理后的第4～7天，小鼠的脾细胞培养上清中的NO2-水平均显著升高（P<0.05）。黑大蒜组NO2-水平于第5天（18.38±0.74）μmmol/L，第6天（24.94±2.21）μmmol/L和第7天（31.10±1.45）μmmol/L也显著高于鲜大蒜组第5天[（16.42±1.18）μmmol/L]，第6天[（19.58±0.86）μmmol/L]，第7天[（22.65±1.85）μmmol/L]（P<0.05或P<0.01或P<0.001）。见图2。

图2 黑大蒜组与鲜大蒜组小鼠脾细胞培养上清NO分泌水平的比较

2.3 脾细胞培养上清中细胞因子的检测结果

在给予小鼠连续5 d注射黑大蒜与鲜大蒜提取物后，正常对照组IL-2的分泌水平（10.15±1.04）pg/mL，黑大蒜组的IL-2分泌水平明显高于正常对照组，于第6天达到峰值[（16.06±0.67）pg/mL]，显著高于鲜大蒜[（10.77±1.47）pg/mL]（P<0.001）。而鲜大蒜组与正常对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；黑大蒜和鲜大蒜组IFN-γ的分泌水平自末次处理后第1天开始就显示高于正常对照组[（19.91±1.94）pg/mL]，于第4天达到高峰，分别为（41.33±3.08）pg/mL和（32.15±2.67）pg/mL。黑大蒜组于第4～5天显著高于鲜大蒜组（P<0.01或P<0.05）；黑大蒜和鲜大蒜组TNF-α的分泌水平自末次处理后第1天开始就显示高于正常对照组[（13.54±1.91）pg/mL]，均于第3天达高峰，分别为（53.98±6.97）pg/mL和（38.46±5.28）pg/mL。末次处理后第1～3天黑大蒜组显著高于鲜大蒜组（P<0.05）；黑大蒜组和鲜大蒜组IL-17的分泌水平均于末次处理后第5天达高峰，分别为（21.29±1.83）pg/mL和（14.55±2.59）pg/mL，前者显著高于后者（P<0.01）。二者均明显高于正常对照组[（11.75±0.81）pg/mL]；黑大蒜组和鲜大蒜组IL-4的分泌水平于末次处理后1周与正常对照组（12.75±1.53）pg/mL比较均未见差异。末次处理后第3、4、5天虽显示黑大蒜组[分别为（10.33±0.78），（10.85±1.49），（11.44±2.99）pg/mL]高于鲜大蒜组[分别为（9.58±1.88），（10.05±1.90），（10.73±1.01）pg/mL]，但二者之间无统计学意义。细胞因子的检测结果见图3。

图3 黑大蒜组与鲜大蒜组小鼠脾细胞培养上清中细胞因子水平检测结果

3 讨论

大蒜是非常易于人类健康的食品，也是中草药的一种。除了日常使用之外，国内外已将大蒜制成各种各样的食用品和保健品，如大蒜油胶囊、大蒜复合饮料、大蒜复合调料、天然大蒜防腐剂、脱水大蒜等[8]用于抗病原微生物、抗肿瘤、降血脂、降血糖、提高免疫功能等改善人体健康及其他方面等。近年来日本学者采用发酵的办法将鲜大蒜制成黑大蒜。黑大蒜去除了原有的辣味而略带有甜味，口感好，无需再经处理可直接食用。如此，使得人们拓宽了对大蒜的研究和应用范围。Sasaki等[4]在对黑大蒜提取物和鲜大蒜提取物的成分进行分析中发现，黑大蒜含S-烯丙基-L-半胱氨酸（S-allyl-Lcysteine，SAC）为194.3μg/g，而鲜大蒜为23.7μg/g；前者含γ-谷胺酰基-S-烯丙基-L-半胱氨酸（γ-glutamyl-S-allyl-Lcysteine，GSAC）的量为248.7μg/g，而后者为748.7μg/g。黑大蒜的各种氨基酸含量与鲜大蒜也不尽相同，前者的酪氨酸、氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和丝氨酸等的含量显著高于后者，有的甚至是后者的2倍。为此，本实验对黑大蒜提取物和鲜大蒜提取物的免疫调节剂作用进行了比较研究，结果显示了二者之间存在不同。

NK细胞不仅具有杀伤病毒感染细胞及肿瘤细胞的作用，而且活化的NK细胞还能分泌多种细胞因子增强免疫监视和免疫调节作用。本实验结果显示黑大蒜增强NK细胞活性的能力要明显优于鲜大蒜。

NO是巨噬细胞活化后产生的一种效应分子，在诱导肿瘤细胞凋亡、抗菌和抗病毒中发挥重要的免疫防御作用。Pedraza等[9]曾报道大蒜能促进体内NO合酶的合成，从而提高NO表达水平。TNF-α是活化巨噬细胞产生的另一种免疫调节因子，可直接抑制杀伤肿瘤细胞，可促巨噬细胞和其他细胞分泌IL-6和IL-8等细胞因子，发挥重要的免疫调节作用。本实验结果表明，黑大蒜诱导NO和TNF-α水平产生明显强于鲜大蒜，说明前者刺激巨噬细胞活化的作用强于后者，这可能提示黑大蒜较鲜大蒜有更强的固有细胞免疫应答的诱导作用。

本实验室先前的研究已经证明，黑大蒜提取物可以诱导以IL-2和IFN-γ为代表的Th1型细胞因子分泌水平明显升高，代表Th2型的细胞因子IL-4未有显著变化[5]。本实验对黑大蒜和鲜大蒜提取物的上述细胞因子的刺激作用进行了比较研究之外，还检测了代表Th17亚群的细胞因子IL-17的产生水平进行了检测。结果发现，二种大蒜提取物均可刺激小鼠脾细胞产生IL-2、IFN-γ和IL-17的水平增高，在产生的高峰期黑大蒜处理小鼠的该3种细胞因子的产生水平显著高于鲜大蒜处理小鼠，提示黑大蒜较鲜大蒜有更强的Th1/Th17型细胞免疫应答刺激作用。二者对IL-4的产生水平无影响。黑大蒜提取物的此种免疫作用机制在本实验室所做的有效治疗过敏性哮喘的研究中得到进一步证实。

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