环磷酰胺在动物模型体内抗肿瘤影响及抑瘤机制的研究

迟淑萍 白冰珂 谢 进 陈红鸽 杜 丽 由莉越 程 云

解放军302医院药学部，北京 100039

肿瘤目前是危害人类健康的主要疾病，环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）作为一种抗癌谱广、疗效较好的抗癌药物，已广泛应用于临床。由于该药物的良好抗癌性能，尤其是具有对癌细胞与正常细胞杀伤力差别很大这一特性，使得其在临床得到了广泛应用。环磷酰胺在细胞水平以及联合用药等方面的研究较多[1-2]，目前肿瘤化疗所应用的大多数药物，都经移植性动物肿瘤试验而被发现，并以此为模型进行疾病发生机制和药物筛选的研究，因此它是筛选抗肿瘤新药中最常用的模型[3]，对研究肿瘤的病因、发病机制、抗癌药物筛选及肿瘤防治等都具有非常重要的意义[4]。现阶段进行的抗癌药物动物实验研究过程中，多采用环磷酰胺作为阳性对照药物，然而，关于环磷酰胺是否具有调节肿瘤相关基因表达而发挥抗肿瘤作用，尚鲜有人报道。本研究旨在通过建立动物模型（腹水瘤模型和移植性S180肉瘤实体小鼠模型），观察肿瘤各相关基因在环磷酰胺药物上的表达情况以及观察环磷酰胺抑制肿瘤的作用，以期进一步对环磷酰胺抑瘤机制作更深一步探讨，为研究抗肿瘤动物模型中阳性对照药物提供实验数据因而发挥更好的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康昆明系小鼠，清洁级：2级，体质量为18～22 g，购自军事医学科学院实验动物中心，合格证号：scxk-（军）2007-004，饲料符合GB14924-94《实验动物全价营养饲料》标准。

1.2 试药

环磷酰胺：山西普德药业有限公司（批号20070310）；小鼠血管内皮细胞生长因子酶免试剂盒（VEGF Elisa Kit）：上海碧云天生物技术研究所；BCA蛋白定量试剂盒：Thermo（批号：JL128100）；液体石蜡油：上海生工生产（生产批号：0110502）；羧甲 基纤维 素钠溶液（CMC）（货 号：CDCU-1096553）上海安谱科学仪器有限公司。

1.3 瘤株

小鼠肉瘤细胞S180，腹水型，鼠源性H22肝癌细胞，由302医院中药研究所惠赠。

1.4 仪器

电子天平：梅特勒-托利多常州称重舍妹系统有限公司制造（型号：SPN202F）；酶联仪：北京新风机电技术公司制造（型号：ZS-3）。

1.5 方法

1.5.1 建立动物模型 取健康昆明系小鼠10只，雌雄各半，腹腔注射液体石蜡油0.5 mL/只，1周后，分别小鼠腹腔接种S180和H22细胞，生理盐水（NS）将其细胞密度调整为2×106/mL，腹腔注射0.5 mL/只，1周后，小鼠腹部涨大按之有波动感，继之将其断颈处死，取出腹水（无菌条件），调整细胞密度为2×107/mL（用RPMI1640培养基洗2次后），分别制成细胞悬液，小鼠右腋皮下接种S180细胞悬液0.1 mL/只（除外对照组），制成局灶型实体瘤模型；小鼠腹腔接种H22细胞悬液0.2 mL/只（除外对照组），建立腹水瘤模型[5]。

1.5.2 实验分组及给药方法 健康昆明系小鼠60只，每组10只，雌雄分盒，排除体重差距大、质量不合格动物，适应性饲养观察1 d后，随机分为六组，即实体瘤模型分为三组：对照组、模型组、环磷酰胺组。对照组给予NS灌胃0.5 mL/只，模型组给予等量1%羧甲基纤维素钠（CMC）溶液灌胃，环磷酰胺组隔日腹腔注射环磷酰胺注射液0.02 g/（kg·d）[6]，0.1 mL/只，连续给药15 d。腹水瘤模型分为三组：对照组、模型组、环磷酰胺组。小鼠末次腹腔接种给药15 d后，按常规继续饲养，观察其存活时间，每天量腹围、称重，直至模型组小鼠全部死亡。实验重复3次。

1.5.3 制备肿瘤瘤体 实体瘤模型小鼠连续接种瘤细胞15 d，末次给药后24 h，测量体重，颈椎脱臼处死，解剖小鼠，剥离瘤体，除去非肿瘤组织包括血污、脂肪、肿瘤新生血管、被膜等，电子天平称取各组肿瘤组织，计算完整剥离后的瘤体平均重量，与模型组比较，计算肿瘤生长抑制率。肿瘤生长抑制率=（模型组平均瘤重-环磷酰胺组平均瘤重）/模型组平均瘤重×100%。

1.5.4 计算小鼠肝、脾指数及生存期延长率 小鼠腹水瘤模型各组接种腹水瘤细胞24 h后分别每日称量体重、量取腹围，按实验要求给药并继续饲喂，直至小鼠死亡前1 d，计算小鼠体重增重数（g）和腹围增长数（cm）。生存期延长率计算法：以接种肿瘤之日算起至模型组小鼠全部死亡结束实验并记录死亡时间。生存期延长率（%）=环磷酰胺组平均生存天数－模型组平均生存天数/对照组平均生存天数×100%；脾脏指数=小鼠脾脏重量（mg）/小鼠体重（g）；肝脏指数=肝脏重量（100 g）/小鼠体重（g）。

1.5.5 检测基因表达 Western blot分析：具体步骤详见《分子克隆》[7]，操作步骤如下：取预冷的玻璃组织研磨器加入所需瘤体组织和组织裂解液500μL[含苯甲基磺酰氟（PMSF）（2±1）μL]，充分研磨裂解半小时，转入离心管中，反复振荡，剧烈涡旋15 s，静置10 min，4℃下12 000 r/min，离心20 min，收集上清至离心管中静置10 min（全部冰上操作），离心取上清，进行蛋白质浓度测定（BCA法）。取蛋白40μg利用Tris甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），12%分离胶和6%浓缩胶，后电转至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭后，加入一抗[血管内皮细胞生长因子（VEGF）、P53、P21、凋亡抑制基因（Bcl-2）；1∶1 000]4℃过夜，缓冲液吐温（tris buffered saline tween，TBST）洗膜后，加入HRP标记的二抗，室温孵育2 h，TBST洗膜后，增强化学发光法（enhanced chemiluminescence，ECL）发光，采用Alpha Ease FC 4.0软件进行光密度分析，结果以蛋白相应水平与β-actin比值表示。

1.6 统计学方法

应用SPSS 12.0软件对数据进行统计处理。计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荷瘤小鼠一般情况

模型组，7 d后生理变化明显出现异常：精神不振、食欲差、畏寒扎堆、体毛稀疏且干涩、行动迟缓、个别出现肉瘤破溃、腹水形成，环磷酰胺组较模型组状况好，但个别亦有少毛、脱毛、精神不振、懒于活动等情况，但无肉瘤破溃及腹水形成。

2.2 环磷酰胺对小鼠S180肉瘤的影响

荷瘤小鼠建模成功，模型组小鼠在接种后第5天即发现有出瘤现象，且发展较快，而环磷酰胺组出瘤时间延长到第10天，且肿瘤生长缓慢。在剥离小鼠瘤块时，亦发现环磷酰胺组的小鼠瘤块体积小，界限分明，质地较硬易剥离，而模型组小鼠的瘤块明显偏大，有的质地软烂、界限模糊，甚至浸润到胸骨和锁骨，不易剥离，与模型组瘤重[（1.31±0.41）g]相比，环磷酰胺组瘤重[（0.15±0.12）g]显著减小（P＜0.01），其抑瘤率达到88.55%，见图1。

图1 环磷酰胺对小鼠S180肉瘤的抑制情况

2.3 腹水瘤小鼠体重、腹围、存活期及肝脾指数的变化

腹水瘤小鼠建模成功，环磷酰胺组小鼠存活天数均较模型组长，生命延长率为57.73%，并且环磷酰胺组腹水相对清亮、色浅，而模型组多为血性腹水，腹围增长也较模型组小，但小鼠体重增加缓慢，且肝、脾指数均比模型组指数小，差异有统计学意义。见表1。

表1 环磷酰胺对小鼠体重、腹围增长、存活期以及肝、脾脏指数的影响（±s）

表1 环磷酰胺对小鼠体重、腹围增长、存活期以及肝、脾脏指数的影响（±s）

注：与对照组比较，①P＜0.05，②P＜0.01；与模型组比较，③P＜0.05，④P＜0.01；“-”表示正常小鼠无需计算生命延长率

组别 体重增长（g）腹围增长（cm）存活天数（d）生命延长率（%）肝脏指数 脾脏指数对照组模型组环磷酰胺组6.76±1.56 4.85±1.21①3.42±1.67②④0.58±0.09 3.17±0.33②2.30±0.66②④-9.7±2.7 15.3±1.1④-0 57.73 4.04±0.47 4.32±0.14 3.26±0.27①④3.45±0.58 3.84±0.56 2.45±0.34①④

2.4 肿瘤组织中各基因表达情况

利用荷瘤小鼠实体瘤子，采用Western blot方法检测主要肿瘤相关信号分子VEGF、P53、P21、Bcl-2。实验结果如表2显示，环磷酰胺组P53蛋白的相对表达量明显高于模型组（con）（P＜0.01）；而P21是该信号通路的经典下游分子，但其表达没有明显的变化；Bcl-2实验结果显示，环磷酰胺组可以明显降低肿瘤细胞内Bcl-2分子的表达量，与模型组相比，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；与肿瘤血管生成密切相关的VEGF基因是大多数抗肿瘤药物的首选靶位点，Western blot检测结果显示：与模型组相比，环磷酰胺组可以明显降低肿瘤细胞内VEGF基因的表达水平（P＜0.01）。见图2。

表2 四种蛋白含量表达水平变化

图2 免疫印迹鉴定分析四种蛋白含量表达水平的变化

3 讨论

环磷酰胺是一种常用的细胞毒抗癌化疗药物，为直接破坏DNA并阻止其复制的抗癌机制，对恶性淋巴瘤、急性或慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤有较好的疗效，对乳腺癌、睾丸肿瘤、卵巢癌等均具有一定的疗效。其药理作用及药代动力学指标均有了较为明确的研究，成为目前抗肿瘤药物实验研究中广泛应用的对照药品。因此，为更好地发挥其在肿瘤动物实验中作为阳性药物的选择性优势，急待进一步研究环酰胺的抗肿瘤作用及其抑瘤机制。而当今抗肿瘤药物主要通过激活或者抑制一系列的肿瘤相关信号通路而发挥治疗肿瘤的作用。经典的肿瘤相关信号通路涉及肿瘤抑癌基因P53，P21信号通路；抗细胞凋亡基因Bcl-2信号通路；血管生长因子VEGF信号通路等。本研究对环磷酰胺的抑瘤作用分别对上述信号通路进行相关检测。

P53是迄今发现与人类肿瘤相关性最高最经典的抑癌基因[8]，研究表明，在人类50%的肿瘤中都发现P53基因有缺失或突变[9]，经实验研究发现，当环磷酰胺作用肿瘤细胞后，能促使P53蛋白明显表达，同时，笔者进行了P53下游分子P21的检测，与对照组相比，P21蛋白表达量却没有变化，由此推测环磷酰胺通过激活P53分子发挥其抑瘤作用，而不是通过P53→P21这条经典的信号通路实现的，这与文献报道相一致[10]。

血管内皮细胞生长因子是目前活性最强、专属性最高的血管生成因子，在肿瘤血管生成中处于核心地位[10]。血管生成过程中的关键因子是VEGF及其受体，它与肿瘤生长侵袭及转移有着密切关联，血管生成更易引起实体瘤的增生和转移，几乎所有的肿瘤都能产生VEGF，并且在肿瘤患者的血清及瘤体内均能检测到异常增高的VEGF[11]。本实验研究表明，环磷酰胺组明显下调瘤体中VEGF蛋白表达水平，因此初步认为，抑制肿瘤的增生可能是环磷酰胺通过降低VEFG的活性而达到抑瘤效果的。根据功能的不同，Bcl-2基因家族可以分为两大类：一类是Bcl-2为代表的抗细胞凋亡基因，另一类是bax促细胞凋亡基因。通常情况下，两种蛋白表达量在细胞内处于相对稳态，而稳态一旦被打破，信号分子Bcl-2的活性更高，最终导致肿瘤细胞的无限增殖，Bcl-2的异常表达已经在一系列肿瘤组织的研究中得到证实[12]。笔者研究发现，与对照组相比，环磷酰胺Bcl-2蛋白表达量明显降低，由此推测可能是通过下调Bcl-2蛋白表达水平而起到抑瘤的作用，具体机制有待进一步实验研究、探讨。

总之，本实验结果表明，环磷酰胺对小鼠S180肉瘤的抑瘤作用稳定，可重复性强，其抑瘤率均可稳定达到70%以上，并可通过促进抑癌基因P53的表达，抑制VEGF的生成，降低抗凋亡基因Bcl-2的表达等多种途径，发挥抑制肿瘤的作用，研究发现该肿瘤相关分子机制，将为环磷酰胺作为抗肿瘤阳性药物动物模型奠定重要的理论基础。

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