生物技术在药用植物三叶青中的应用研究进展

杜苏瑞，向太和，李 朦

（杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江杭州 310036）

生物技术在药用植物三叶青中的应用研究进展

杜苏瑞，向太和，李 朦

（杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江杭州 310036）

三叶青是一种珍稀的中草药，其提取物含有三叶青黄酮、β－谷甾醇和多糖等，具有良好的抗肿瘤作用，临床上已经用于抗癌、抗艾滋病毒，治疗血液病、心脑血管疾病、肝炎和病毒性脑膜炎等.该文从三叶青的人工栽培、离体快速繁殖和细胞培养、药用活性成分分析等方面，综述了生物技术应用于三叶青中的研究进展，并对今后研究方向进行了展望.

三叶青；生物技术；应用；进展

三叶青，又称为金线吊葫芦或金丝吊葫芦，学名三叶崖爬藤（TetrastigmahemsleyanumDielsetGilg），为葡萄科（Vitaceae）崖爬藤属植物，是一种极其珍稀的中草药，全草皆有药用价值，其中地下块根和果实的药用效果最好，晒干或鲜用［1－2］.

三叶青的药用价值最早见于《本草纲目》，称“三叶崖爬藤，性味苦、辛、凉，清热解毒、活血祛风”.现代医学研究证实，三叶青对于高热、肺炎、肝炎、胃炎、子宫颈炎、淋巴结核、败血症等严重感染性疾病均有明显疗效［3］；特别是三叶青的提取物三叶青黄酮、β－谷甾醇、多糖等能有效抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，具良好的抗肿瘤作用［4－10］，且无毒副作用［11］.目前三叶青的提取物已经在临床上用于抗癌、抗艾滋病毒，治疗血液病、心脑血管疾病、肝炎、病毒性脑膜炎等［12］.然而，三叶青对生长环境要求非常奇特，它需生长在海拔700m的深山密林和悬崖峭壁的背阴面，上面要有散射光，旁边要有细水渗出，下面要有树叶覆盖，气温保持在18℃左右才有利于其生长，现仅在浙江、广西、江西等山区有少量的自然分布；并且在自然条件下生长速度缓慢.由于三叶青对生长环境要求苛刻，加上无节制的人为采挖，在自然条件下已濒临灭绝；而现代生物技术，尤其是细胞工程和基因工程技术，对三叶青的保护和利用具有重要的意义.目前有关生物技术在三叶青应用研究主要集中在如下几个方面.

1 三叶青的人工栽培、离体快速繁殖和细胞培养

由于三叶青在自然条件下逐渐稀少，为此，人们试图通过各种生物技术来达到繁殖和保护三叶青的目的.牟豪杰和董爱兰采用人工种植的方法，选择海拔为200～800m、土壤颗粒度为2～5mm的山地背阴面，将野生三叶青枝条剪成带有2～3个节的茎段扦插于开耕好的垄上，并覆盖5cm厚的稻草，每年的6～8月份搭建遮荫棚，则第3年即可对三叶青地下块根进行采掘［13］.浦锦宝等通过利用500mg/L的生根粉溶液浸泡插穗的下切口，移栽15d后施用钙肥，也实现了人工繁育三叶青的目的［14］.吉庆勇等研究发现利用1 000mg/L IBA浸渍三叶青2～3年生老枝插条10s后，扦插于黄土中生根效果最佳；而基质对插穗生根的影响不明显［15］.此外，刘杰书等报道对野生的三叶青进行分株后，采取防腐、适当遮光、合理浇水、病虫防治等人工驯化的措施，以利于三叶青的人工栽培与养护［16］.

在组织培养快繁方面，钱丽华首次报道利用茎段的腋芽和试管不定芽作为起始外植体，通过丛生芽分化途径实现了三叶青的离体快速繁殖［17－18］.徐刚等发明了一种组织培养快速繁殖三叶青的方法，在试管内可以快速大量繁殖三叶青组培苗，月增殖率达3～5倍，年组培苗生产能力每平方米培养室面积可达1万苗以上［19］.姜维梅等也报道发明了一种三叶青的组培快速繁殖方法，通过对外植体的选取与处理、诱导培养、增殖培养、生根培养、移栽等步骤实现了三叶青的快速繁殖［20］.钟毓倩利用茎尖、带腋芽的茎段和叶作为外植体，研究发现最佳诱导外植体为茎尖，诱导不定芽的培养基配方以MS＋2mg/L6－BA＋0.2mg/L NAA为最佳，而生根培养基以1/2MS＋0.5mg/L IBA＋1mg/L NAA为最佳［21］.值得一提的是，卢爱芳等以无菌苗叶片、野生三叶青叶片和茎段为外植体，诱导获得愈伤组织，探究用组织培养获得的愈伤组织来快速生产三叶青黄酮的可行性；他们的研究结果发现，三叶青愈伤组织的最佳诱导培养基为2/3MS＋2.0mg/L 6－BA＋2.0mg/L NAA，最佳增殖培养基为MS＋2.0mg/L 6－BA＋2.0mg/L NAA，最佳生根培养基为1/2MS＋1.0mg/L 6－BA＋1.0mg/L NAA；分析结果显示：三叶青总黄酮含量在块根中为31.135mg/g，在叶片中为12.830mg/g，在愈伤组织中高达18.047mg/g［22］.本课题组利用组织培养技术获得了三叶青愈伤组织和再生小植株（图1A和B），并利用发根农杆菌侵染三叶青外植体，成功诱导出毛状根（图1C）（待发表），这为利用毛状根快速生产三叶青药用活性成分奠定了技术基础.

图1 三叶青组织培养获得的愈伤组织、小植株及发根农杆菌侵染诱导出的毛状根Fig.1 Callus and plantlet of Tetrastigmahemsleyanumvia tissue culture and hairy root of Tetrastigmahemsleyanuminduced by Agrobacteriumrhizogenes

上述研究中，人工栽培主要采用扦插和分株的方式；离体快速繁殖主要通过调整细胞分裂素6－BA和生长素NAA或IBA的激素浓度，实现了植株的再生和快速繁殖.

2 三叶青的生理生化分析和DNA指纹分析

有学者利用生理生化分析技术和DNA标记指纹技术等研究了生态环境等外部条件对三叶青生长的影响.钱丽华等研究了温度对三叶青鲜重、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和可溶性蛋白等生理指标的影响；试验结果表明：30～35℃为三叶青试管组培苗最适宜生长温度，一个月后每克平均鲜重增加达到4.402 7～5.149 3g；在该温度下，其SOD酶活性增强、MDA含量偏低、膜修复能力增强、可溶性蛋白含量增加；而40℃以上高温或10℃以下低温则不利于三叶青试管组培苗的生长［23］.Dai Y等研究了光照对三叶青的光合效率、叶绿素荧光和叶绿素含量的影响，结果显示：光照辐射抑制三叶青的光合同化过程，而大约67%的遮荫条件最适合三叶青的栽培生长［24］.

袁带秀研究发现，不同产地的三叶青酯酶同工酶和过氧化同工酶存在差异［25－26］.黄真等从性状特征、显微特征及一般理化鉴别等方面对浙江和广西两种不同产地三叶青进行生药学鉴别，结果表明：浙江三叶青与广西三叶青的大小、表面、断面颜色及特征皆有不同，浙江三叶青水浸液粘性十足，而广西三叶青水浸液不明显；并且两者导管排列方式有明显的不同［27］.符渊淼利用DNA指纹技术对不同产地的三叶青进行了种质鉴定，DNA条形码特征分析显示，rbcL、matK、trnH－psbA、ITS的变异位点数分别为18、39、64和236，平均种间遗传距离分别为0.006 3、0.004 9、0.018 4和0.074 5，平均种内遗传距离分别为0.000 1、0.000 2、0.000 6和0.003 6；rbcL、matK、trnH－psbA、ITS分别可以鉴定22.2%、61.1%、66.7%和93.8%的不同产地的种群；三叶青可以被ITS或多片段条形码准确鉴定［28］.

3 三叶青的药用活性成分分析

三叶青的提取物中含有多种药用活性成分.生物技术，尤其是色谱分析技术在分析三叶青药用成分的种类和含量中发挥着重要作用.杨大坚等从三叶青块根的氯仿提取物中分离得到3个化合物：6′－O－苯甲酰基胡萝卜苷、胡萝卜苷和β－谷甾醇［29］.刘东和杨峻山采用溶剂提取和硅胶柱层析法对三叶青药用成分进行分离，根据化合物的理化性质和光谱数据鉴定，从石油醚萃取物中分离得到4个化合物：蒲公英萜酮、蒲公英萜醇、β－谷甾醇和麦角甾醇［30］.刘东等报道从三叶青中分离得到9个化合物：α－香树脂醇、三十二酸、水杨酸、丁二酸、胡萝卜苷、山奈酚－7－O－β－L－吡喃鼠李糖－3－O－β－D－吡喃葡萄糖苷、没食子酸乙酯、甘露醇和环四谷氨肽［31］.Liu D等报道从三叶青中得到1种新的黄酮碳苷［32］.李瑛琦等从三叶青块根的醋酸乙酯萃取物中分离得到7个化合物，经过鉴定，结构明确的有4个：β－谷甾醇、山奈酚、槲皮素和山奈酚－3－O－新橙皮糖苷［33］.霍昕等在三叶青块根乙醚提取物中共分离出21个化合物，检测出18个组分，其中含量较高的是亚油酸、棕榈酸、油酸、二苯胺、亚麻酸甲酯和硬脂酸［34］.

另外，有学者探讨了对三叶青药用成分进行测定和分离的方法.毛一亮等利用正交试验法，以总黄酮含量为考察指标，优化三叶青中总黄酮的提取工艺，结果显示：最佳提取工艺为1∶15倍煎药液得量、回流提取2次、每次3h［35］.郑军献等利用紫外可见分光光度法测定了三叶青中总黄酮的含量［36］.周国惠和黄建城建立了HPLC同时测定三叶青中的槲皮素和山奈酚的方法［37］.陈科敏等采用超声处理，以乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数为考察因素，用分光光度法测定总黄酮含量，正交试验结果显示最佳超声提取工艺为：12倍量的50%乙醇、超声提取3次、每次1.5h［38］.张立明等以乙醇溶液为提取溶剂，采用响应面设计方法，对影响总黄酮提取效果的3个因素（乙醇浓度、液料比和提取时间）进行中心组合设计试验，并建立数学模型，获得了以乙醇作为溶剂提取三叶青中总黄酮的最佳工艺方法［39］.刘江波等选择了10种国产大孔树脂，以三叶青总黄酮的吸附量和解吸率为指标，经HPD826大孔树脂一次纯化后的产物中，三叶青总黄酮含量提高了2.44倍，HPD826大孔树脂能较好地用于分离纯化三叶青总黄酮［40］.浦锦宝等利用高效液相色谱法建立了三叶青中槲皮素、山奈酚含量的测定方法.槲皮素、山奈酚的加样回收率分别为100.58%、99.35%，可用于三叶青药材中槲皮素、山奈酚的含量测定，并评价药材的质量优劣［41］.

4 展 望

目前，三叶青的人工栽培、组织培养快速繁殖都取得了成功，但对这些人工快繁后代所含有的药用成分含量尚缺少系统的研究，是否达到自然条件下生长的水平还有待分析.此外，三叶青作为野生药用植物资源，不同产地的生态环境等因素对其药用品质的影响、其细胞遗传学特征、遗传图谱的构建尚未开展研究.另一方面，虽然利用气相色谱技术对三叶青药用活性成分进行了分析，但尚不清楚其究竟含有多少种药用活性成分，这些活性成分的化学结构组成如何；特别是三叶青药用活性成分合成途径的关键酶和功能基因的研究未见任何报道.上述领域都有待在今后深入开展研究.

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Biotechnology Application in Herbal PlantTetrastigma HemsleyanumDielsEtGilg

DU Su－rui，XIANG Tai－he，LI Meng

（College of Life and Environment Sciences，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310036，China）

TetrastigmahemsleyanumDielsetGilg is one kind of rare and precious herbal plant，the extractives of which include flavanone，β－sitosterol，polysaccharide and so on.It has excellent anti－tumor function and has already been clinically used in the treatments of cancer，HIV，nosohemia，cardia－cerebrovascular disease，hepatitis and viral meningitis.This paper reviewed the research progress of biotechnology application inTetrastigmahemsleyanumDielsetGilg from the aspects of manual cultivations，rapid propagation and cell culture as well as medical bioactive ingredients analysis，and looked forward to the direction of further studies.

TetrastigmahemsleyanumDielsetGilg；biotechnology；application；progress

Q943

A

1674－232X（2012）02－0142－04

11.3969/j.issn.1674－232X.2012.02.010

2011－09－11

杭州市科技发展计划项目（20110232B10）.

向太和（1965—），男，教授，博士，主要从事植物基因工程研究.E－mail：xthcn＠163.com