基于ITO电极的细胞色素c吸附层的直接电化学

张 喆 祁志美 张蓉君

(中国科学院电子学研究所,传感技术国家重点实验室,北京100190)

基于ITO电极的细胞色素c吸附层的直接电化学

张 喆 祁志美*张蓉君

(中国科学院电子学研究所,传感技术国家重点实验室,北京100190)

采用未经修饰的铟锡氧化物(ITO)工作电极直接探测到了细胞色素c(Cyt c)吸附层的氧化还原峰,并得出了Cyt c的表面浓度,随着溶液浓度从2 μmol·L-1增大到10 μmol·L-1,Cyt c的表面浓度相应地从0.35×10-12mol·cm-2增大到1.53×10-12mol·cm-2.实验获得的表面浓度倒数与溶液浓度倒数的准线性关系说明Cyt c在ITO表面的吸附基本满足Langmuir等温吸附理论.对Cyt c溶液的循环伏安测试结果表明参与电极反应的Cyt c包括游离分子和吸附分子,前者的贡献大于后者,电极反应主要受扩散控制并呈准可逆过程.根据Nicholson方法估算得到反应物的标准异相速率常数的平均值为1.65×10-3cm·s-1.实验结果显示在室温下放置1 h后Cyt c吸附层电化学活性部分丧失,在80°C下放置1 h后吸附层完全失活.失活的Cyt c吸附层对铁氰化钾溶液在Au电极上的电极反应具有明显的阻碍作用.

细胞色素c吸附层;直接电化学;Langmuir等温吸附;表面浓度

1 引言

细胞色素c(Cyt c)是一种典型的氧化还原蛋白质,它广泛存在于动植物体内,并在线粒体的呼吸链中起着传递电子的重要作用,因此获得了广泛研究.1-27Cyt c分子含有一个亚铁血红素基团,具有电化学活性,常采用电化学的方法对它进行研究.由于Cyt c的电化学活性中心被肽链所包裹,活性中心不能直接接触电极,电子在电极与活性中心之间的转移是通过特定电子转移链进行的.研究表明Cyt c分子在金电极表面的吸附非常强,会导致蛋白质失活,从而影响了分子内部的特定电子转移链,使得电子在活性中心与电极间的传输受到抑制.7,8因此,利用普通金电极对Cyt c进行直接电化学测量较为困难,通常需要对电极进行表面修饰以及在待测溶液中加入促进剂,1-26这为Cyt c的电化学研究带来了很大的不便.

铟锡氧化物(ITO)玻璃具有导电能力强,化学稳定性强,不易引起Cyt c变性和无需对电极表面进行任何修饰即可对Cyt c进行直接电化学测量的优点.22-27ITO玻璃还具有良好的透光性,容许在电化学测量的同时进行光学测量(如光谱电化学测量).28在pH=7.2的水溶液中,Cyt c与ITO电极带有相反的电性,Cyt c分子可以通过静电作用吸附在ITO电极的表面,这为Cyt c吸附层的直接电化学测量提供了可能性.已有文献大多通过对金电极进行复杂的表面修饰后再研究Cyt c溶液的直接电化学,与此相比,采用ITO电极研究Cyt c的直接电化学要简单得多.

本文采用未经修饰的ITO导电玻璃作为工作电极,铂片作为对电极,Ag/AgCl作为参比电极,对低浓度下Cyt c吸附层和Cyt c溶液在ITO电极上的直接电化学进行了研究,并根据测量结果对反应物的动力学参数进行了计算.实验分析了Cyt c吸附层分子的活性对电化学反应的影响.此外,还采用裸露的Au工作电极研究了Cyt c吸附层对K3Fe(CN)6/ K4Fe(CN)6电极反应的影响.

2 实验部分

2.1 试剂与仪器

马心Cyt c(纯度≥95%)购自美国Sigma公司,使用前未经进一步提纯,铁氰化钾(纯度≥99.5%)、亚铁氰化钾(纯度≥99.5%)、磷酸二氢钾(纯度≥99.5%)及十二水合磷酸氢二钠(纯度≥99%)购自国药集团化学试剂有限公司,硝酸钾(纯度≥99%)购自西陇化工股份有限公司,均为分析纯,实验中使用的去离子水经过Milli-Q纯净水机二次净化.Reference 600型电化学分析仪购自美国Gamry公司.蠕动泵购自保定兰格恒流泵有限公司.

2.2 实验方法

以10 mmol·L-1的磷酸缓冲溶液(PBS,pH=7.2)为底液,配制了浓度分别为2、4、6、8、10 μmol·L-1的马心Cyt c溶液.以0.2 mol·L-1的硝酸钾水溶液为底液,配制了铁氰化钾/亚铁氰化钾[K3Fe(CN)6/ K4Fe(CN)6]的混合溶液,Fe3+和Fe2+离子的浓度均为1 mmol·L-1.电化学测试系统由三电极组成:Ag/ AgCl为参比电极,铂为对电极,ITO(或Au)为工作电极,两种工作电极的实际反应面积均为1 cm2.

3 结果与讨论

3.1 利用ITO电极研究Cyt c吸附层的直接电化学性能

Cyt c和ITO的等电点分别为10和6,6,29因此在pH 7.2的溶液中Cyt c分子带正电而未加电压的ITO电极显负电性,使得Cyt c分子可以通过静电作用吸附在ITO电极表面.实验时,我们采用蠕动泵注入和抽取溶液样品,因此在整个实验过程中无需将电极从反应池中取出,从而确保各电极位置不变.在利用ITO电极对其上的Cyt c吸附层进行直接电化学测量前,首先对PBS底液进行了循环伏安扫描,如图1曲线a所示,在-200-200 mV的扫描区间内,没有观察到PBS底液的氧化还原峰.之后将反应池中的PBS底液用4 μmol·L-1的Cyt c溶液代替并静置约15 min后再次进行循环伏安测量,结果如图1曲线c所示,可以明显观察到Cyt c的特征氧化还原峰,氧化峰位于82 mV(vs Ag/AgCl)附近,还原峰位于13 mV(vs Ag/AgCl)附近.为了消除Cyt c溶液对测量结果的影响,将Cyt c溶液取出并对反应池进行清洗后再次注入PBS底液对在ITO上形成的Cyt c吸附层进行循环伏安测量,结果如图1中曲线b所示,在与曲线c近似相同的电压区间出现了一对氧化还原峰,该氧化还原峰完全对应于ITO电极表面的Cyt c单分子吸附层的氧化还原过程.曲线c的峰电流比曲线b的大,说明Cyt c溶液的循环伏安测量结果既包含表面吸附的蛋白质分子的贡献又有溶液中游离的蛋白质分子的贡献.

图1 利用ITO电极测得的不同条件下的循环伏安曲线Fig.1 Cyclic voltammograms measured using ITO electrodes under different conditionsPBS:phosphate buffered solution

根据Laviron模型,吸附层循环伏安法的峰电流ip可以表示为式(1)的形式:30,31

进而推导出电化学活性物质的表面浓度Γ的计算式(2):

其中,Q为测得的Cyt c吸附层的还原峰电量,相应于图1中曲线b的还原峰电量,n为电极反应的得失电子数(对于Cyt c,n=1),A为电极的实际反应面积, ν为扫描速率,F为法拉第常数,R为理想气体常数,T为绝对温度.当Cyt c溶液的浓度为4 μmol·L-1时,对曲线b的还原峰面积积分得到的Q值为92.32×10-9C,此时Γ为0.96×10-12mol·cm-2,略小于文献3,13,22-24报道的修饰电极的Γ值.由于Cyt c分子在ITO电极表面的非可逆吸附,每完成一组实验后需要更换一片新的ITO电极再进行测量.采用相同方法还测试了溶液浓度为2、6、8、10 μmol·L-1时的Cyt c吸附层的循环伏安曲线,并对每一条曲线的还原峰面积积分得到不同溶液浓度(C)所对应的Cyt c表面浓度Γ.结果表明当溶液浓度从2 μmol·L-1增加到10 μmol·L-1,Γ相应地从0.35×10-12mol·cm-2增大到1.53×10-12mol·cm-2,并呈现出饱和趋势.按照Langmuir等温吸附模型,表面浓度Γ与溶液浓度满足如下方程:

其中,Γmax为最大表面浓度,X为常数.由方程(3)可知,表面浓度Γ的倒数(Γ-1)与溶液浓度C的倒数(C-1)呈线性关系(即:ΓmaxΓ-1=1+KC-1).图2显示了实验获得的Γ-1与C-1的关系曲线,二者呈准线性关系(线性拟合度为0.9514),说明Cyt c分子在ITO表面的吸附近似满足Langmuir等温吸附模型.

图2 在ITO电极上测得的Cyt c表面浓度倒数与溶液浓度倒数的准线性关系Fig.2 Quasi-linear relationship between the two reciprocals of surface concentration and solution concentration measured with ITO electrodes

我们还利用Cyt c溶液的循环伏安曲线对Γ值进行了计算(电量Q相应于图1中曲线c的还原峰电量),结果指出随着Cyt c溶液浓度从2 μmol·L-1增大到10 μmol·L-1,Γ从0.83×10-12mol·cm-2增大到5.01×10-12mol·cm-2.相同溶液浓度下Cyt c溶液所对应的Γ值是Cyt c吸附层所对应的Γ值的2至3倍,说明在对Cyt c溶液进行循环伏安测试时,溶液中游离的Cyt c分子对电极表面反应的贡献大于电极表面吸附的Cyt c分子的贡献.

3.2 利用ITO电极研究Cyt c溶液的直接电化学

图3 利用ITO电极测得的10 μmol·L-1Cyt c溶液的循环伏安曲线Fig.3 Cyclic voltammograms of the 10 μmol·L-1 Cyt c solution measured with the ITO electrodev(scan rate)/(mV·s-1):(a)10,(b)20,(c)50,(d)100

图3为利用ITO电极测得的10 μmol·L-1Cyt c溶液的循环伏安曲线.曲线由内至外对应的扫描速率分别为10、20、50和100 mV·s-1.由氧化还原峰电位计算得到的Cyt c溶液的标准氧化还原式电位E0ʹ=(Epa+Epc)/2=(60.80±6.00)mV(vs Ag/AgCl),与Hill等1,2采用修饰的Au电极对Cyt c的测量结果250 mV(vs NHE)接近.表1给出了不同扫描速率下Cyt c溶液的氧化还原峰电位差ΔEp=Epa-Epc=(90.80± 4.00)mV,大于单电子电极反应所对应的58 mV,且|ipa|≠|ipc|,这说明Cyt c溶液在ITO电极上发生的是准可逆的氧化还原反应.31

表1 25°C时Nernst体系对应的ΔEp和ψ的文献值31,32以及计算得到的k0Table 1 Literature values31,32of ΔEpand ψ in the Nernst system at 25°C and the calculated k0

图4所示为氧化还原峰电流与电压扫描速率平方根的关系曲线.随着扫描速率的增加,峰电流值随之增大(图中电流的正负号仅代表电流的方向),且呈准线性关系,表明溶液中游离的Cyt c分子在ITO电极上的反应主要受扩散控制.2,6-9,27根据Nernst方程得出峰电流ip如式(4)所示:31

其中,ip为峰电流(单位:A),n为参与电极反应的电子数(对于Cyt c,n=1),A为电极的实际反应面积(单位:cm2),D为反应物的扩散系数(单位:cm2·s-1),ν为扫描速率,C为反应物的初始浓度.将图4线性拟合曲线的斜率代入式(4)计算得到溶液中的被氧化的Cyt c分子和被还原Cyt c分子的扩散系数分别为DO=0.61×10-6cm2·s-1和DR=1.39×10-6cm2·s-1,与文献2,7,10,27报道的值接近.

图4 氧化峰和还原峰电流与扫描速率平方根的准线性关系Fig.4 Quasi-linear dependences of the redox peak currents on the square root of scan rate

根据Nicholson方法,31,32标准异相速率常数k0可以通过式(5)计算得到:

其中,ψ为与ΔEp(峰电位差)相关的循环伏安法的无量纲速率参数,可通过查询表1确定,T为绝对温度(室温298 K),α为无量纲的电子传递系数.对于单步骤单电子反应过程,假设α=0.5,将各参数代入式(5)计算得到不同扫描速率下的k0值列于表1,与文献7,10,16-18,27,32报道的值接近.

3.3 Cyt c吸附层活性对电极反应的影响

Cyt c活性的好坏直接影响电化学反应的结果,为此采用ITO工作电极在4种不同条件下进行了循环伏安测试,电解液均为PBS底液.实验结果如图5所示,其中曲线a对应于未修饰的ITO电极,曲线b对应于载有Cyt c吸附层的ITO电极(即:Cyt c/ITO电极),曲线c是将Cyt c/ITO电极在25°C下空气中静置1 h的测量结果,曲线d是将Cyt c/ITO电极在80°C下空气中干燥1 h后的测量结果.从曲线a可以看出在扫描区间内没有氧化还原峰出现,曲线b可以观察到在55 mV附近出现一对氧化还原峰,对应于在ITO电极表面吸附的Cyt c分子的氧化还原过程,曲线c中的氧化还原峰电流的强度有所下降,表明在25°C下空气中静置1 h后,Cyt c吸附层中的部分分子失去了活性,曲线d同样没有观察到氧化还原峰,说明在80°C下干燥1 h后Cyt c吸附层的电化学活性完全丧失.

图5 利用ITO电极和PBS电解液测得的不同条件下的循环伏安曲线Fig.5 Cyclic voltammograms obtained using the ITO electrode and PBS electrolyte under different conditions bare ITO electrode(a),ITO electrode with a Cyt c adlayer(Cyt c/ITO electrode)(b),Cyt c/ITO electrodes kept at 25°C for 1 h(c) and at 80°C for 1 h(d)

图6 利用Au电极在吸附Cyt c前(a)后(b)测得的K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6混合溶液的循环伏安曲线Fig.6 Cyclic voltammograms of K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 mixed solution obtained with aAu electrode before(a)and after(b)Cyt c adsorption

采用Au电极对浓度为2-10 μmol·L-1的Cyt c溶液进行循环伏安测量,均未观测到Cyt c的特征氧化还原峰.已报道的文献7,8指出,Cyt c与Au电极强烈的吸附作用导致Cyt c分子的三级结构发生变化,从而丧失电化学活性.为了研究Cyt c吸附层对Au电极特性的影响,实验中采用K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6的混合溶液作为电解液进行了测试.图6所示为Au电极表面吸附Cyt c前后对K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6混合溶液进行循环伏安法测量的结果.曲线a是吸附前的测量结果,从图中可以看出氧化还原峰电位差较小且氧化还原峰电流较大,表现为可逆的氧化还原反应.曲线b是吸附后的测量结果,与曲线a对比发现峰电位差增大,反应的可逆性变差,且峰电流也有较大的降幅,说明失活的Cyt c吸附层对Au电极的电极反应具有一定的阻碍作用.

4 结论

采用未经修饰的ITO工作电极对Cyt c吸附层进行了原位直接电化学研究,并基于循环伏安曲线计算得到了在不同溶液浓度下的Cyt c表面浓度,进一步得出Cyt c表面浓度的倒数与溶液浓度倒数呈准线性关系,说明Cyt c在ITO电极表面的吸附近似遵循Langmuir等温吸附模型.对Cyt c溶液的直接电化学研究表明电极反应受扩散控制,并且表现为准可逆的氧化还原过程,根据Nicholson方法估算得到反应物的标准异相速率常数的平均值为1.65× 10-3cm·s-1.Cyt c吸附层的活性可以通过电化学信号的强弱反映,25°C下在空气中静置1 h后,Cyt c吸附层分子部分失活;在80°C下放置1 h后,Cyt c吸附层分子完全失活.实验还采用Au工作电极研究了Cyt c吸附层对K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6电化学反应的阻碍作用.

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December 2,2011;Revised:February 16,2012;Published on Web:February 24,2012.

Direct Electrochemistry of Cytochrome c Adlayer on the ITO Electrode

ZHANG Zhe QI Zhi-Mei*ZHANG Rong-Jun
(State Key Laboratory of Transducer Technology,Institute of Electronics,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,P.R.China)

The electrochemical redox reaction of a cytochrome c(Cyt c)adlayer on an indium tin oxide (ITO)electrode was directly monitored and the surface concentrations of Cyt c versus solution concentrations were obtained from cyclic voltammograms.The results indicate that the surface concentration increases from 0.35×10-12to 1.53×10-12mol·cm-2when the solution concentration is increased from 2 to 10 μmol·L-1.A quasi-linear relationship between the reciprocals of surface concentration and solution concentration was observed,indicating that Cyt c adsorption on the ITO electrode closely obeys the Langmuir isothermal adsorption model.The cyclic voltammograms of the Cyt c solutions with the ITO electrode reveal that both adsorbed and dissociated Cyt c molecules are involved in the electrode reaction and that the contribution of dissociated molecules is much larger than that of adsorbed ones.The electrode reaction is basically diffusion controlled and quasi-reversible.Based on the Nicholson method, the average standard heterogeneous rate constant was determined to be 1.65×10-3cm·s-1.The electrochemical activity of the Cyt c adlayer was partially lost when it was kept at 25°C for 1 h,and was completely lost at 80°C.The denatured Cyt c adlayer on a gold electrode can effectively inhibit the electrode reaction of K3Fe(CN)6solution.

Cytochrome c adlayer;Direct electrochemistry;Langmuir isothermal adsorption; Surface concentration

10.3866/PKU.WHXB201202241

∗Corresponding author.Email:zhimei-qi@mail.ie.ac.cn;Tel:+86-10-58887196.

The project was supported by the National Key Basic Research Program of China(973)(2009CB320300),National Natural Science Foundation of China(60978042,61078039),and BaiRenJiHua Program of ChineseAcademy of Sciences.

国家重点基础研究发展规划项目(973)(2009CB320300),国家自然科学基金(60978042,61078039)和中国科学院“百人计划”择优支持项目资助

O646