松醇油降解菌的分离鉴定及降解条件优化

梁杰慧，孙水裕，杜青平，刘敬勇，黄绍松，尹光彩，田 静，曾佳俊，许娉婷

(广东工业大学 环境科学与工程学院，广州 510006)

松醇油是国内外铅锌硫化矿选矿中使用最广泛的起泡剂，它是在以松节油为原料、硫酸为催化剂，酒精或平平加(一种表面活性剂)为乳化剂的参与下，发生水解反应制取的。其主要化学成分萜烯醇是一种环状结构，难以自然降解，会残留在选矿废水中[1-3]，从而导致选矿废水的化学需氧量(COD)升高，使选矿废水难以达标排放并对水体中的动植物和人类构成威胁[4-5]。

目前，国内外处理选矿废水的方法主要有酸碱中和法[6]、混凝沉降法[7]、化学氧化法[8]、人工湿地法[9]和微生物法[10]。酸碱中和法和混凝沉降法存在结垢严重、沉淀污泥量大、易造成二次污染等弊端，且不易去除残留在选矿废水中的有机浮选药剂(如黄药和松醇油)，化学氧化法处理费用高；人工湿地法占地面积大，易受外界环境的影响；微生物降解法具有高效降解有机污染物、无二次污染、费用低等优点，已经引起越来越多研究者的关注[5]。LI等[11]用两段接触氧化生物吸附反应器处理铜矿选矿废水，经过长期运营发现该反应器能有效去除重金属，化学需氧量和氨氮的去除率分别达到 84.1%和 71.3%。HE等[12]采用厌氧/生物活性碳反应器对模拟选矿废水进行处理，在最佳碳水比(质量比)为2:1、最佳气水比(质量比)为3:1、水力停留时间为4 h时，可将模拟废水COD浓度由300 mg/L降至 100 mg/L以下。LI[13]研究了葡萄球菌Auricularis对矿山废水中重金属的生物吸附能力，发现当菌剂量为15 g/L时，100 mg/L Cu和50 mg/L Zn的去除率分别是 77.1%和 56.3%。张萍等[14]及肖华花[15]从南京某硫化矿溢流井废水中分别筛选出能高效降解捕收剂黄药和黑药的降解菌，初步鉴定为假单胞菌属，并研究了其降解特性。但目前国内外对选矿废水生物处理的研究主要针对重金属离子、黄药、黑药等目标污染物的去除或降解，对于微生物法降解选矿废水中常见起泡剂松醇油的研究还未见报道。本文作者对亚洲最大的硫化铅锌矿——广东省韶关市凡口铅锌矿尾矿库周边的土样进行取样、富集、培养，并分离出一株以松醇油为唯一碳源的高效降解菌，研究其对松醇油的降解特性及最佳条件，从而为微生物净化处理含残留松醇油的尾矿库废水提供试验依据。

1 实验

1.1 培养基

无机盐培养基按照文献[15]配制；以松醇油为唯一碳源的富集培养基：将无机盐培养基灭菌，冷却后加入松醇油；固体选择培养基：在富集培养基的基础上，加入20 g/L琼脂粉；牛肉膏蛋白胨培养基用于制备种子液和菌种斜面保存。

1.2 松醇油降解菌的富集分离

实验土样采自凡口铅锌矿尾矿库周边的土壤。细菌富集分离过程采用定时定量、逐步提高松醇油浓度的方法。将实验土样于37 ℃生化培养箱活化3 d，称取5.0 g土样于盛有100 mL已灭菌的富集培养基(加入1%松醇油)的锥形瓶中，在37 ℃、120 r/min水浴摇床中培养7 d后，以10%(体积分数)的接种量接入新鲜的富集培养基(加入2%松醇油)，同样条件下培养7 d。继续提高碳源浓度，以同样的接种量接入新鲜的富集培养基(加入3%松醇油)，相同条件下驯化7 d。取最后富集液用稀释平板法进行分离，选取单菌落接种到以松醇油为唯一碳源的固体选择培养基上，反复多次，最终得到分离和纯化，选取生长良好的单菌落保存。

1.3 分离菌株的鉴定

对分离筛选得到的松醇油降解菌 KS-1，参照文献[16-17]，采用菌落形态观察、生理生化特征实验及16SrDNA序列分析相结合的方法进行鉴定。将16SrDNA测序结果运用BLAST软件与GenBank数据库中的序列进行比较，从中获得与菌株 KS-1序列最相近的 16SrDNA 序列(即参照序列)，然后使用CLUSTAL X 1.81软件对菌株KS-1的序列和参照序列进行对比，利用MEGA 3.1软件，采用邻接法构建系统发育树。

1.4 菌悬液的制备

在无菌条件下，选取单菌落接种到已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基，在37 ℃、120 r/min摇床中培养16 h，并将菌液在12 000 r/min条件下离心15 min，去掉上清液，用已灭菌的无机盐培养基重悬，使细菌的数目达到108 mL-1。

1.5 松醇油降解试验

松醇油由广东省韶关市凡口铅锌矿选厂提供。无菌条件下，按照15%的接种量将菌悬液接种到已灭菌的无机盐培养基中，并加入松醇油使得松醇油的浓度为300 mg/L，在37 ℃、150 r/min摇床中培养7 d。为研究松醇油降解菌对选矿废水中COD的降解能力，在本研究中采用 COD来衡量目标菌株对松醇油的降解效果。每天定时取上述培养液在12 000 r/min条件下离心15 min，取上清液测定COD；同时取样直接测定细菌生长量。COD按照文献[18]测定。菌株生物量采用比浊法[19]于600 nm处测定其吸光度，即OD600值。

1.6 正交试验设计

运用正交试验法研究松醇油降解菌的降解特性。根据文献[20]确定本实验的影响因素为4个，4因素3水平可采用 L9(34)正交表。选择对降解菌生长影响较大的pH值、接种量、摇床转速和松醇油浓度4个因素作为考察对象。松醇油降解菌的降解条件的因素与水平见表1。

表1 松醇油降解菌降解条件的正交因素与水平Table 1 Orthogonal factors and levels of degradation conditions by pine oil degrading bacteria

2 结果与讨论

2.1 菌株的分离及鉴定

2.1.1 形态及生理生化特征

以松醇油为唯一碳源富集分离，逐步驯化，筛选出一株能在固体选择培养基中生长迅速、外形较大的菌株作为试验菌株，命名为KS-1。菌株KS-1在牛肉膏蛋白胨固体培养基上培养24 h后，菌落表面粗糙不透明，呈白色或微黄色。菌株 SEM 像显示，该菌株为杆状，菌体大小为(1.0±0.05)μm×(1.8±0.2)μm，如图1所示。菌株革兰氏染色结果为阳性，呈芽孢椭圆状或柱状，位于菌体中央或稍偏，有鞭毛，能运动。

图1 菌株KS-1的SEM像Fig.1 SEM image of KS-1

根据文献[16-17]有针对性地进行生理生化试验，结果见表2。表2表明，菌株 KS-1好氧，接触酶试验、硝酸盐还原试验和V-P测定呈阳性反应，能利用葡萄糖、木糖、甘露醇、柠檬酸盐，能水解淀粉和明胶，不能利用吲哚、卵黄卵磷脂酶、苯丙氨酸脱氨酶和丙酸盐。以上鉴定结果与微生物分类法[16-17]和王海峰等[21]报道的枯草芽孢杆菌的生理生化特征一致。初步确定菌株KS-1为枯草芽孢杆菌。

表2 菌株KS-1的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characters of KS-1

2.1.2 16SrDNA序列分析

将菌株提取基因组DNA后进行16S rDNA片段的PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳检测，并进行测序，序列长度为 1 458 bp，在 GenBank中登录号为GU272021。将菌株KS-1的16S rDNA的基因序列运用BLAST软件和GenBank中的序列进行同源性比较，结果表明，菌株KS-1与Bacillus subtilisAF0907序列同源性达100%。结合菌株KS-1株的菌株形态特征和生理生化特征，鉴定菌株 KS-1为枯草芽孢杆菌AF0907(Bacillus subtilisAF0907)。菌株的系统发育进化树见图2。

2.2 化学需氧量(COD)变化特性

将菌株活化并制备菌悬液后接种到松醇油降解培养基中，测定 COD去除率和 OD600值，结果如图3所示。

图2 菌株KS-1的系统发育进化树Fig.2 Phylogenetic tree of KS-1

图3 菌株KS-1对松醇油的降解结果Fig.3 Degrading results of pine oil by KS-1

从图3可以看出，COD的去除率与菌株KS-1生长量的变化趋势基本吻合。接种后的第 1～3天菌株KS-1处于延滞期，细菌生长量少，COD的去除率不高，对松醇油的降解速度较慢。这是因为当菌株从营养丰富的培养基转移到一个营养不良培养基时，会出现延滞期；在特定培养基中，细胞生长必须具备一套完整的酶系去合成培养基中不存在但对细胞来说又是必需的代谢物。当微生物转移到新鲜的培养基时，需要时间去合成新的酶[22]。从第3天开始菌株生长量持续快速增加，菌株处于对数生长期，此时细菌数量多且活性高，COD的去除率不断升高，对松醇油的降解明显加快，表明此阶段菌株充分利用自身合成的酶，以松醇油为碳源，大量繁殖。到第6天COD的降解率达到51.9%，第7天菌株生长量和COD去除率都开始下降，这是由于培养基中碳源松醇油的消耗，中间代谢产物的产生，细胞毒素的积累，细菌繁殖速度下降。

目前，关于松醇油的吸附去除与臭氧氧化法去除已有研究。张晓茜[23]研究了不同滤料(镁渣滤料、铝渣、石英砂)对松醇油的吸附作用，发现在相同的松醇油浓度下，镁渣滤料吸附容量最大，但松醇油去除率只有12.904%。欧阳魁[24]用臭氧法去除松醇油，当臭氧氧化6 min时，松醇油去除率达到95.26%，但臭氧不稳定、易分解、不能贮存，必须在使用现场制造，且臭氧发生器能耗高、设备操作及维修麻烦，水质水量变化时，投加量调节困难，因此，臭氧氧化法应用于大量尾矿库废水的治理成本过高，工程应用可能性小。与以上方法相比，在本研究中筛选得到的菌株KS-1对松醇油的降解效率高、成本低、无二次污染，且枯草芽孢杆菌对不同营养化水体的净水作用已有报道[25]，表明菌株 KS-1在降解废水中松醇油具有良好的应用前景。

2.3 松醇油降解菌降解条件优化

根据文献[20]，运用综合平衡法对试验结果进行极差分析，结果见表3。计算步骤如下：逐列计算各因素同一水平之和，记作X1、X2和X3；逐列计算各水平的平均数记作、和；逐列计算各水平平均数的极差，记作R。计算公式如下：

2.3.1 主次顺序的确定和初选优化降解条件

根据表3可知，对于试验指标OD600，4个因素极差由大到小的顺序为RA、RC、RB、RD。由此可知，各因素对菌株 KS-1的生长情况影响由大到小的顺序为A、C、B、D；根据各因素水平的值，确定各因素的优化水平组合为A1B3C3D2。对于试验指标COD降解率，4个因素的极差由大到小的顺序为RD、RC、RB、RA。由此可知，各因素对 COD降解率影响由大到小的顺序为D、C、B、A；根据各因素水平的值，确定各因素的优化水平组合为A2B3C3D3。

2.3.2 综合平衡法确定最优降解条件

由于两个指标单独分析得到的优化条件不一致，必须对因素的影响主次顺序进行综合考虑，确定最佳降解条件。

表3 松醇油降解菌降解条件正交试验的极差分析Table 3 Orthogonal test intuitive analysis chart of degradation conditions for pine oil degrading bacteria

对于因素A，其对OD600值影响最大，排第1位，取A1为好；但其对COD降解率的影响排第4位，为次要的。因此，应以OD600值这一指标考虑，选取A因素为A1。对于因素B，其对OD600值和COD降解率影响都排第3位，且均取B3为好，故B因素选取B3。对于因素C，其对OD600值和COD降解率影响都排第2位，且均取C3为好，故C因素选取C3。对于因素D，其对COD降解率影响排第一位，取D3为好；其对OD600值的影响排第4位，为次要的。因此，应以COD降解率这一指标考虑，选取D为D3。

本实验的优化组合为A1B3C3D3，即pH值为4，接种量为15%，摇床转速为200 r/min，松醇油浓度为300 mg/L。此优化组合即是试验3，试验指标COD从653.27 mg/L下降到222.70 mg/L，去除率达到65.91%，OD600为0.239，均为最大值。结果表明，菌株在酸性条件下生长良好，能够降解高浓度松醇油，且在松醇油浓度较高的情况下，适当增大接种量和提高摇床转速可以提高菌株KS-1对松醇油的降解率。

3 结论

1)从广东省韶关市凡口铅锌矿尾矿库周边土壤中筛选出一株能高效降解松醇油的细菌KS-1，经对其进行形态特征、生理生化特征鉴定及 16SrDNA序列分析，鉴定菌株KS-1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis AF0907)。

2)松醇油降解菌降低含松醇油废水COD的优化条件如下：pH 4、接种量15%、摇床转速200 r/min、松醇油浓度300 mg/L，在此条件下，COD从653.27 mg/L降到222.70 mg/L，去除率达到65.91%。

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