非清髓预处理后自体外周血造血干细胞移植治疗难治性重症肌无力远期疗效观察

叶宝东 邵科钉 陈丹 张宇 吴迪炯 周郁鸿 沈一平 俞庆宏 沈建平

重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是一种影响神经－肌肉传递的获得性自身免疫病，表现为局部或全身肌肉的无力及疲劳症。多数患者使用免疫抑制、胸腺切除、抗胆碱酯酶药、免疫球蛋白、血浆置换等治疗后可获得长期缓解［1］。然而仍有少数难治性MG患者对常规治疗无效，严重影响生活质量，极易出现MG危象而危及生命。自体造血干细胞移植(autologous hematopoietic stem cell transplantation，auto-HSCT)是治疗难治性MG的有效方法之一，其远期疗效报道较少。我们观察了浙江省中医药大学附属第一医院2005年2月至2010年2月期间采用非清髓预处理方案行纯化的CD34+细胞auto-HSCT治疗5例难治性MG患者的远期疗效，报道如下。

1 对象与方法

1．1 对 象

5例MG患者符合以下难治性MG定义［2］:(1)免疫抑制剂依赖，减小剂量即复发;(2)免疫抑制治疗后临床症状不能控制;(3)免疫抑制剂不良反应较大，难以耐受。2005年2月至2010年2月期间采用FAC预处理方案行纯化的自体外周血CD34+细胞移植的难治性MG患者5例，均为女性，中位年龄36(27～47)岁，中位病程3(1～22)年。5例患者移植前均使用抗胆碱酯酶药和多种免疫抑制剂、大剂量静脉用免疫球蛋白冲击和血浆置换等治疗，但不能控制症状，其中有4例已行胸腺瘤切除术。4例患者因多次MG危象出现严重呼吸衰竭而行气管插管、呼吸机辅助通气治疗，其中1例因1年内2次行气管切开术，一直未封管至移植前。5例患者在行干细胞动员前均有肌力明显下降表现，肌力为Ⅱ～Ⅲ级，有吞咽困难、进食呛咳、呼吸困难等症状，肌疲劳试验阳性，肌电图呈重频刺激递减现象。4例患者乙酰胆碱受体抗体和胸腺瘤相关抗体阳性。3例CMV抗原阳性者予以更昔洛韦治疗后转阴。

1．2 外周血造血干细胞动员、采集及CD34+细胞分选

采用环磷酰胺(cyclophosphamide，Cy)4 g/m2，分2 d 给药;粒细胞集落刺激因子5 ～10 μg·kg－1·d－1，从白细胞数跌至最低日开始使用至干细胞采集结束当天。当外周血白细胞数达(2～4)×109/L以上，单核细胞占全部白细胞的21% ～30%时，用血细胞分离机(COBE SPECTRA，美国金宝公司)采集外周血造血干细胞，循环血量为自身全血容量的2倍左右，根据移植需要每例患者采集2～3次。外周血采集物在采集后24 h内进行CD34+细胞分选，将采集物与抗CD34抗体(人源，德国美天旎生物技术公司)充分混合后，应用细胞分选仪(Clini MACS，德国美天旎生物技术公司)进行CD34+细胞分选、计数，将纯化后的CD34+细胞按比例加入干细胞低温冻存保养液(5%二甲基亚砜，5%人血白蛋白，肝素10 U/mL)，CD34+细胞终浓度为(4～5)×109/L，按每袋50 mL分装，－80℃冰箱冷冻保存。

1．3 预处理方案

使用非清髓预处理(改良FAC)方案:磷酸氟达拉滨(fludarabine)30 mg·m－2·d－1，共 4 d;抗胸腺细 胞 球 蛋 白 (antithymocyte globulin，ATG)2．5 mg·kg－1·d－1或抗淋巴细胞球蛋白(antilyphocyte globulin，ALG)30 mg·kg－1·d－1，共 4 d;Cy 50 ～60 mg·kg－1·d－1，共 2 d。移植均在干细胞动员后1～2个月进行。

1．4 CD34+细胞的回输及其他用药

于预处理结束后48 h回输自体外周血CD34+细胞。取出－80℃冰箱冷冻保存的CD34+细胞置于42℃水浴箱解冻，回输前予地塞米松5 mg静脉推注，CD34+细胞在解冻后10～15 min内从静脉输注。留取标本进行台盼蓝染色计算活细胞数。移植后第2天开始予粒细胞集落刺激因子每天5μg/kg皮下注射，至中性粒细胞计数达0．5×109/L以上时停用。移植后所有患者继续原泼尼松、溴吡斯的明治疗。在造血功能恢复后，根据临床症状缓解程度，再逐渐减少泼尼松、溴吡斯的明用量，直至停用。

1．5 动态监测指标

移植后动态监测患者的血常规变化，观察造血恢复;于移植前及移植后第1、6、12个月时采集血标本，进行自身免疫抗体检测，同时应用流式细胞仪检测外周血淋巴细胞亚群表达，T淋巴细胞选择CD3、CD4、CD8，B淋巴细胞选择 CD19，NK细胞选择CD16、CD56。

1．6 统计学分析

统计学分析采用SPSS 15．0软件。治疗前后均数比较采用配对样本t检验:对正态分布指标用方差分析，并作两两比较;对非正态分布指标用非参数检验，多组间比较用Kruskal-Wallis H检验，两两比较用Mann-Whitney U检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2．1 外周血干细胞采集和CD34+细胞分选结果

5例患者均1次动员成功，均采集2次。获得单个核细胞数为(6．07 ±0．94)×108/kg，其中CD34+细胞数为(3．46 ±1．23)×106/kg。经分选CD34+细胞数为(2．06 ±0．69)×106/kg，细胞纯度为(82．10 ±6．03)%，回收率为(60．59 ±5．74)%。

2．2 造血和免疫重建情况

5例患者中性粒细胞计数达0．5×109/L以上中位时间10(8～12)d;血小板计数达20×109/L以上中位时间11(8～12)d。

所有患者移植前T淋巴细胞亚群分布与正常人群的分布接近。但移植后1个月T淋巴细胞、B细胞、NK细胞均较移植前下降(P＜0．01);移植后6个月上述指标升高(P＜0．01或 P＜0．05)，并在移植后12个月达到移植前水平。CD4+细胞移植后恢复速度及程度均较CD8+细胞显著，详见表1。

2．3 疗 效

5例患者在行干细胞动员后肌力均有不同程度恢复，表现为吞咽困难、进食呛咳和呼吸困难症状减轻，但是肌疲劳试验仍阳性。

移植后1个月，4例患者无明显肌无力症状出现，四肢肌力均达到V级，复查肌电图明显好转，肌疲劳试验为阴性。1例气管切开患者于移植后3个月四肢肌力达到V级，肌疲劳试验仍为阳性。4例乙酰胆碱受体抗体、胸腺瘤相关抗体阳性患者在移植后1个月抗体转阴2例，另2例在移植后6个月抗体转阴。所有患者在移植后3～6个月停用所有药物治疗。

全部患者均随访至2012年2月，中位随访时间44(24～84)个月，其中4例患者肌力正常，恢复正常生活、工作，脱离药物治疗，1例气管切开患者移植后12个月因疾病复发而再次应用小剂量泼尼松、溴吡斯的明维持治疗，目前MG症状控制良好，生活自理。5例患者移植后疾病状况见表2。

2．4 不良反应

5例患者干细胞动员时无明显不良反应发生，呕吐、轻微骨痛2例，经对症处理后缓解。预处理后有发生ATG或ALG所致的血清病样反应(包括高热、皮疹、小关节疼痛)3例，加用甲泼尼龙或氢化考的松治疗后缓解。移植前3例CMV抗原阳性患者予更昔洛韦治疗后转阴，移植后未发生CMV感染。移植后发生两下肺轻度细菌感染2例，应用抗感染药物后均有效控制。未发生肝静脉闭塞病及出血性膀胱炎。

3 讨论

异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)在理论上可完全或接近完全免疫重建，是治愈自身免疫病的理想方式，因此有的移植中心开始应用allo-HSCT治疗难治性自身免疫病［3］。但是由于allo-HSCT后移植物抗宿主病等移植相关并发症较高，限制了其在难治性自身免疫病中的推广应用。Auto-HSCT的优点在于无移植物抗宿主病发生的危险，移植相关病死率较低，患者生活质量较好，是目前治疗难治性自身免疫病的主要移植技术，但缺点是疾病复发率较高［4］。因此，如何减少疾病复发，提高远期疗效是目前auto-HSCT治疗难治性MG的难点。

表1 5例难治性重症肌无力患者移植前后淋巴细胞亚群变化(¯x±s)

表2 5例难治性重症肌无力患者移植后疾病状况

在难治性自身免疫病行auto-HSCT治疗中，多数中心应用Cy(1．5～4 g/m2)联合粒细胞集落刺激因子动员造血干细胞，也可单用粒细胞集落刺激因子动员。有相当一部分患者采用了CD34+细胞分选移植［5］。目前使用的预处理方案采用非清髓预处理方案，如单用白消安、单用 Cy(150 mg/kg或200 mg/kg)，联合ATG，全身照射联合化疗，也有应用卡莫司汀、阿糖胞苷、白消安和依托泊苷联合预处理［4］。FAC方案属非清髓预处理方案，相对于清髓预处理方案具有预处理剂量低、毒副作用小，细胞植入速度快，多数患者能形成完全嵌合的特点，其目的在于使供受者之间产生双向免疫耐受，适合于非肿瘤性疾病，年龄较大，有心、肝、肾、脑功能异常的患者。Auto-HSCT治疗难治性MG的主要机制在于摧毁原有的免疫系统，通过自体干细胞输注重建免疫并形成新的免疫耐受，不需要大剂量预处理方案清除肿瘤细胞，故非清髓方案更为适合。FAC方案可避免预处理骨髓抑制期较长带来的致死性出血、感染危险，减轻药物及全身照射对重要器官的损害。目前只有3个前瞻性随机临床试验在验证造血干细胞移植对自身免疫病的影响，方案分别采用Cy 200 mg/kg、ATG(兔)7．5 mg/kg，CD34+分选;Cy 120 mg/kg，ATG(equine)90 mg/kg，全 身 照 射 800 cGY，CD34+分选;Cy 200 mg/kg，ATG 7．5 mg/kg，未行CD34+分选［6］。目前尚未见完整的疗效分析结果。

为了提高auto-HSCT对难治性MG的疗效，我们尝试应用纯化的自体外周血CD34+细胞移植治疗，经分选得到 CD34+细胞数为(2．06±0．69)×106个/kg，细胞纯度为(82．10 ±6．03)%。预处理方案则采用非清髓的Cy+氟达拉滨+ATG/ALG方案。目前已完成的5例难治性MG患者的移植过程均顺利，一般在移植后30 d患者血象完全恢复正常，未出现相关严重并发症。通过检测自身免疫抗体、肌电图等进一步评估病情，所有患者临床症状缓解。目前中位随访时间已44(24～84)个月，其中4例患者肌力正常，恢复正常生活和工作，脱离药物治疗;1例气管切开患者移植后12个月出现活动后肌无力症状，肌电图有重频刺激递减现象，提示疾病复发。但是复查患者乙酰胆碱受体抗体和胸腺瘤相关抗体均为阴性，且移植前已经行胸腺瘤切除术，复发可能与患者移植前病程已达22年有关。再次应用小剂量泼尼松(10 mg/d)、溴吡斯的明(60 mg/次，每天3～4次)维持治疗后肌无力症状控制良好，目前生活自理。

值得注意的是，有资料显示自身免疫病患者在auto-HSCT治疗后有少部分出现了至少1个其他继发性自身免疫病。多因素分析结果提示使用ATG和细胞分选移植是重要危险因素［7］，故这些患者仍需加强自身免疫病的随访以防止远期并发症的发生。

1 Kim JY，Park KD，Richman DP．Treatment of myasthenia gravis based on its immunopathogenesis［J］．J Clin Neurol，2011，7(4):173-183．

2 Nowak RJ，Dicapua DB，Zebardast N，et al．Response of patients with refractory myasthenia gravis to rituximab:a retrospective study［J］．Ther Adv Neurol Disord，2011，4(5):259-266．

3 Strober J，Cowan MJ，Horn BN．Allogeneic hematopoietic cell transplantation for refractory myasthenia gravis［J］．Arch Neurol，2009，66(5):659-661．

4 Daikeler T，Tichelli A，Passweg J．Complications of autologous hematopoietic stem cell transplantation for patients with autoimmune diseases［J］．JPediatr Res，2012，71(4 Pt 2):439-444．

5 Farge D，Labopin M，Tyndall A，et al．Autologous hematopoietic stem cell transplantation for autoimmune diseases:an observational study on 12 years'experience from the European Group for Blood and Marrow Transplantation Working Party on Autoimmune Diseases［J］．Haematologica，2010，95(2):284-292．

6 Tyndall A．Successes and failures of stem cell transplantation in autoimmune diseases［J］．Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2011，2011:280-284．

7 Daikeler T，Labopin M，Di Gioia M，et al．Secondary autoimmune diseases occurring after HSCT for an autoimmune disease:a retrospective study of the EBMT Autoimmune Disease Working Party［J］．Blood，2011，118(6):1693-1698．