HMGB 1分子A-Box的表达纯化及其促分化功能鉴定的研究

曹小芳 王恒湘 何梓铭 王芳 杨洋 郭子宽

（何梓铭，王芳，杨洋，郭子宽）。

高迁移率族蛋白（High mobility group box 1，HMGB1）是广泛存在于真核生物细胞核内的染色体结合蛋白，也存在于细胞质和细胞外，具有多种生理和病理学作用，主要由A-box、B-box及酸性尾端3个结构域组成[1]。HMGB1与炎细胞表面的RAGE受体、TLR22和TLR24等受体相互作用后可引起细胞内信号转导途径的活化,释放炎性因子[2]。细胞坏死或损伤时,在肿瘤坏死因子的作用下，细胞核内的HMGB1可释放到胞外,刺激单核巨噬细胞分泌促炎因子，促炎因子又可促进HMGB1的分泌，形成正反馈环。在炎性反应的后期，这种正反馈效应对RA等疾病炎性反应的维持具有重要的作用[3-4]。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSC）是一类具有多向分化能力的成体干细胞，在适宜的条件下，可以分化为成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、血管内皮细胞、肝脏细胞、神经细胞和心肌细胞等[5]。值得关注的是，间充质干细胞所处的微环境可能对其生物学特性产生相应的影响，赋予其独立的特征。然而，HMGB-1 A-box对MSC的作用研究甚少。为探讨HMGB1A-box是否具有促成骨作用，我们进行了其表达载体构建、重组蛋白纯化和生物学活性的研究。

1 材料和方法

1.1 材料

pGEM-T Easy Vector Systems购于Promega公司；pET24a HMGB1基因由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；E.coli DH5α 和 BL21 PlySs（DE3）大肠杆菌感受态购于北京Transgen公司；人骨髓间充质干细胞由本室保存；测序公司为北京奥克生物技术公司；质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒均购于北京天根生物公司；限制性内切酶BamHI、XhoⅠ购于Promega公司；蛋白定量试剂盒购于申能博彩生物技术有限公司；小鼠源HMGB1抗体为sigma产品；HRP2羊抗鼠2IgG购于Millipore公司；DNA marker购于天根生物技术公司；蛋白Marker购于上海生物工程有限公司；诱导剂IPTG为BBI产品；Western blot化学发光底物为Santa Cruz产品；α-MEM培养基购于Sigma公司；胎牛血清购于Hyclone公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成

根据HMGB1基因序列，设计HMGB1 A-box上、下游特异性引物：5′-CAAATGGGTCGCGGATCCGAATTC-3′（划 线处 为 BamHI 酶 切 位 点 ）；5′-AAAAAGCTCGAGCACCACCACCACC-3′（划线处为XhoⅠ酶切位点）。上述引物均由北京奥克生物技术公司合成。

1.2.2 重组DNA技术

以质粒pET24a HMGB1为模板扩增目的基因，PCR回收产物与pGEM-T Easy Vector载体按摩尔数4:1的比例加入反应体系，室温连接4h后转化E.coli DH5α感受态。转化完成后，将菌液涂布于Amp+的LB琼脂板（先将5μL 1M 的IPTG 和20μL 50 mg/mL的X-gal涂布于琼脂板上）上，菌液体积要有一定梯度。将涂布好的琼脂板倒置于37℃的培养箱中，培养12～16 h，至平板上出现可辩的蓝、白菌落，将白色菌落标号，提质粒行酶切鉴定和DNA测序鉴定重组子。重组pGEM-T AboxA-box经BamHI、XhoⅠ双酶切分离目的基因片段，插入表达载体HIS-tag的相应位点。阳性克隆扩菌，保存菌种并提取质粒备用。

1.2.3 重组蛋白的表达

经鉴定的阳性重组表达载体pET24a+转化E.coli BL21感受态菌株，挑取单个克隆菌落扩增培养至对数生长期。加入诱导剂IPTG，终浓度为1 mmol/L，37℃诱导4h。细菌裂解物行SDS-PAGE电泳，凝胶图像拍照记录，分析目的蛋白表达水平。

1.2.4 包涵体的制备、蛋白纯化和验证

重组菌株扩菌,超声破碎。离心收取沉淀(包涵体)。按照 MagneHISTM Protein purification system cat说明书裂解包涵体。重组菌株的超声上清与His-Link亲和层析柱4℃充分结合3 h，将亲和层析柱连于HID-2核酸检测仪，洗涤和洗脱获得纯化的重组蛋白，透析去除洗脱液中的咪唑等小分子物质。SDS-PAGE检测蛋白纯度。用小鼠源HMGB1单抗和辣根过氧化酶标记的抗小鼠二抗行Western blot，鉴定重组蛋白。

1.2.5 重组蛋白的生物学活性测定

收获传代3次的hBMSC，悬浮于含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中，按12000个细胞/孔接种于24孔培养板中。培养体系分为：①阴性对照组，培养体系为含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基；②阳性对照组，培养体系中加入50 μg/mL维生素C磷酸盐，10 mM的磷酸甘油钠盐，10-7M地塞米松钠盐；③A-box组，体系中加入A-box，浓度分别为6.25 μg/mL，12.5 μg/mL，25 μg/mL 和 50 μg/mL。每组4孔。3次实验使用细胞来源于3个不同个体。培养1周后，吸除培养上清，1%多聚甲醛固定后，NBT/BCIP试剂进行碱性磷酸酶染色，倒置显微镜观察。

2 结果

2.1 重组表达载体的构建

以pET24a HMGB1为模板,行PCR扩增。 琼脂糖凝胶电泳显示扩增的基因片段约250 bp,与目的基因片段大小相符(图1)。

图1 PCR结果显示A-box目的片段Fig.1 Human HMGB1 A-box showed by DNA sequencing

图2 pGEM-T A-box质粒酶经BamHI和XhoⅠ酶切后琼脂糖电泳结果。1，3，5道分别代表不同细菌克隆的质粒；2，4，6道分别代表相应质粒酶切后电泳结果；7道是DNA分子标准物Fig.2 The targeted cDNA fragment separated by agarose gel electrophoresis after enzyme digestion by BamH I and Xho I.1,3,5:different recombinant vector;2,4,6:different recombinant vector after enzyme digestion;7:DNA marker

将目的片段插入克隆载体pGEM-T,挑选阳性克隆，提取质粒并进行BamH I和XhoⅠ双酶切鉴定，证实克隆片段大小为250 bp（图2），符合预期结果。将质粒DNA回收，进行质粒DNA序列测定，测序结果与Genebank所记载的序列完全相符。

将克隆载体质粒用BamHI和XhoⅠ消化，纯化目的片段并将之插入原核表达载体pET24a+的HIS-tag相应位点，酶切验证所插入片段为250 bp左右（图3），与目的条带大小相符合，证实获得了人HMGB1 A-box的重组表达载体。

图3 pET24a+/A-box酶切鉴定结果。1，3代表双酶切结果；2，4代表质粒；5代表DNA分子标准物Fig.3 The targeted cDNA fragment after enzyme digestion by pET24a+/A-box.1,3:recombinant vector after enzyme digestion;2,4:recombinant vector;5:DNA marker

2.2 重组蛋白的表达

阳性重组菌株诱导前、后和含有pET24a+/A-box菌株裂解液均行SDS-PAGE。诱导后裂解pET24a+/A-box阳性重组菌株，电泳证实在相对分子质量约为11000处可见一明显蛋白条带,与预期蛋白大小相符(图4)。目的蛋白质总量约为菌体总量的45%。

图4 转染的阳性细菌目的蛋白表达情况。1-3分别代表：蛋白质分子标记物，IPTG诱导的菌体裂解液，未诱导的菌体裂解液。箭头所指为目的蛋白大小Fig.4 A-box expression after transfection.1:marker;2:bacterium spallation induced by IPTG;3:un-induced bacterium spallation;arrow:the targeted protein

2.3 重组蛋白的纯化

将重组菌体扩增后，IPTG诱导表达。收集菌体，超声破碎包涵体，收获裂解上清，行His柱亲和层析，并收获目的蛋白。SDS-PAGE电泳显示，经纯化后，未见杂蛋白条带，表明收获蛋白纯度较高（图5）。

用小鼠源HMGB1单抗和辣根过氧化酶标记的抗小鼠的二抗行Western blot，以HMGB-1蛋白分子为阳性对照，以鉴定重组蛋白。结果两者均能与抗体发生特异性反应，表明重组蛋白为特异性人HMGB1 A-box蛋白（图 6）。

2.4 重组蛋白的生物学活性

我们的前期实验表明，HMGB1能诱导hBMSC向成骨细胞分化[6]。鉴于A-box是HMGB1分子的受体结合区，A-box可能具有相似的作用。实验表明，hBMSC培养体系中加入A-box，1周后进行碱性磷酸酶染色发现，随着A-box浓度增加，细胞染色逐渐变强，甚至较阳性对照孔细胞深。因此，A-box具有明显的促MSC分化为成骨细胞的作用（图7）。

图5 经纯化后蛋白电泳图。1-3：包涵体裂解物经纯化后，上清经纯化后，蛋白质分子标准物。箭头为目的蛋白大小Fig.5 A-box expression after purification.1:inclusion lysate after purification;2:supernatant after purification;3:marker;arrow:the targeted protein

图6 Western blot结果。以HMGB1蛋白为阳性对照，证实所纯化蛋白为A-boxFig.6 A-box expression tested by western blot and HMGB1 was taken as positive control

图7 A-box体外促MSC成骨分化作用。将人MSC培养于含10%胎牛血清的低糖DMEM（A），或在体系中加入成骨诱导剂组合（B），A-box（6.25 μg/mL）（C），A-box（12.5 μg/mL）（D），A-box（25 μg/mL）（E）和 A-box（50μg/ml）（F）。 NBT/BCIP染色显示碱性磷酸酶阳性细胞（成骨细胞）Fig.7 The induction-promoting effects on mesenchymal stem cells of A-box in vitro.A:normal medium;B:ossification revulsant added medium;C:6.25 μg/mL A-box added medium;D:12.5 μg/mL A-box added medium;E:25 μg/mL A-box added medium;F:50 μg/mL A-box added medium

3 讨论

HMGB 1含215个氨基酸残基,是高迁移率族蛋白的超家族成员之一。HMGB1是一个炎性因子，在自身免疫性疾病和脓毒血症等疾病发生发展中，起着十分重要的作用[7]。此外，间充质干细胞表达相关受体，可受HMGB-1趋化而迁徙至炎性组织，并在其作用下分化为成骨细胞[6]。因此，HMGB-1也可能参与了某些骨关节疾病的发病过程[8]。

HMGB1含有两个结构区域，称为A-box和B-box。其中，A-box是HMGB1细胞受体结合区域，B-box为效应区域。因此，体系中加入A-box单体，可竞争阻断HMGB1与受体的结合，从而抑制HMGB1引起的炎症反应。因此，A-box单体作为HMGB1拮抗剂，有可能用于自身免疫性疾病和败血症的治疗[9-11]。文献报道，HMGB1是重要的炎症因子，广泛参与各种急、慢性炎症过程，并在疾病的转归中起关键作用[11]。因而，以HMG蛋白作为药物治疗的靶点在炎症性疾病的研究中具有重要意义[10-11]。

我们的研究证实，A-box单体与HMGB-1类似，可促进MSC向成骨细胞分化，这种作用呈现剂量依赖性。A-box的作用具有双重性，即抗炎性反应和促成骨分化作用，为其在多种疾病中的应用提供了独特的可行性。如类风湿性关节炎，它是一种由免疫反应介导的关节局部炎性反应，在疾病后期，常出现骨蚀等骨关节损伤。因此，结合本实验结果可以推测，利用A-box单体治疗，可以通过阻断HMGB-1的活性，以抑制骨关节局部的炎性反应；而且，可以通过促成骨作用，加速骨组织损伤的修复。再如，骨折后骨不连同时存在炎性反应和骨修复障碍。A-box单体的双重作用，在促进局部MSC分化为成骨细胞的同时，拮抗由组织坏死引起的炎性反应，可能适用于此类疾病的治疗。然而，A-box能否真正应用于上述疾病，具体的应用途径和剂量，以及A-box单体是否具有其它生物学效应，仍需大量研究探讨。

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