角膜神经的研究进展△

王 存 夏潮涌 傅 婷 李志杰

自1830年Sohlemm在角膜缘发现角膜神经后，人们对角膜神经展开了一系列的研究。由于角膜组织没有血管，因此角膜的营养与代谢基本都由角膜神经代劳。角膜上皮含有丰富的神经末梢，因此对刺激非常敏感，且具有保护眼前节的作用。业已发现，许多眼表疾病和手术都与角膜的神经支配密切相关，本文就角膜神经目前的研究进展作一综述。

1 概述

1.1 角膜神经的起源 角膜神经主要包括感觉神经、交感神经与副交感神经。早期研究证实，许多哺乳动物如小鼠、猴、猫、大鼠和兔的角膜感觉神经大多数来自三叉神经的眼神经分支，少数来自三叉神经的上颌支。其实，Bǎke早在1935年就发现位于角膜基质层的粗神经束内存在某种纤维，并推测其中较细的纤维是交感神经纤维，但未加以证实。1993年，Marfurt和Ellis进一步证实所有哺乳动物的角膜都含有来自颈上神经节的交感神经纤维，但其密度存在显著的种系间差异。例如，在兔和猫的角膜中，交感神经占角膜神经的10%～15%，而在包括人的灵长类动物的角膜中，交感神经是极其罕见的[1]。通过选择性去神经和退化神经描记法研究小鼠和猫的角膜时发现，副交感神经来自睫状神经节。但是关于人类角膜上是否有副交感神经纤维至今仍未明确[2]。

1.2 研究角膜神经的方法 从最初使用传统组织免疫方法和光学显微镜研究角膜神经，到后来使用荧光组织免疫法和活体共聚焦显微镜描绘角膜神经的整体构造，短短70 a，研究方法有了突破性的进展，但这些方法都各有利弊。氯化金染色法、乙酰胆碱酯酶染色法和美蓝活体组织染色法均使用离体样本，和体内环境存在不可避免的差异。业已证实，人体死后角膜神经会立即退化，因此结果会存在一定的误差。自90年代中期起，共聚焦显微镜被普遍用于检测人体正常和异常角膜神经的形态学特征[3]。但是，美中不足的是它无法记录直径小于0.5 μm的神经分支及末梢。针对这一不足，He等[4]采用改进的免疫荧光染色成像法展示上皮与间质神经网络的细节，并提供了整个角膜神经网络的横断视图。

辣根过氧化物酶(hores radish peroxidase，HRP)轴浆运输法是检测角膜神经功能学的主要方法之一。利用HRP逆轴浆运输的特性，将HRP注射于角膜植片中央，HRP会被逆轴浆运输到三叉神经节，再通过固定染色等步骤统计三叉神经节的个数，用以评价再生神经的功能。此外，角膜知觉是反映角膜神经功能的一项重要指标，角膜感觉功能的检查包括接触式和非接触式两种。Cochet 2-Bonnet角膜知觉仪操作简便，且能对角膜知觉进行精确定量，是目前最常用的方法之一[5]。

2 角膜神经的分布与形态学结构

位于角膜周围的神经束呈放射状，分布于角膜表面，并于角膜全厚约前1/3处进入角膜。神经束在距角膜缘约1 mm处脱去神经束膜和髓脂鞘，仅存雪旺细胞，继续向角膜中央方向迁移[1]。在此过程中，神经纤维会分为双叉、三叉或丁字形继续前行，行至前弹力层时，神经纤维会在前弹力层下互相重叠形成致密的神经丛，然后穿过前弹力层，止于上皮细胞之间。但是，不同物种角膜神经发育的具体过程有所差异，如C57/BL6小鼠在角膜神经发育初期，神经纤维直接呈放射状伸向角膜中央和上皮，并未事先在角膜外周形成一个神经环[6]。

2.1 基质神经 基质神经位于角膜基质的前中部，起源于巩膜或睫状体[7]。主要的基质神经束进入角膜后，分支成更细的基质神经纤维，并迁移至角膜上皮形成上皮神经网络[4]。人类正常角膜中基质神经的直径为5.5～11.4 μm[3]。部分基质神经纤维在一些分支点相互连结形成密度适中的基质中部神经丛，而位于角膜不同部位的基质中部神经丛的组成与密度有所差异。位于角膜外周的基质中部神经丛主要由一些小直径的直的或弯曲的神经纤维以及多弯拐的神经纤维组成[8];而角膜中央的基质中部神经丛则主要由细的和弯曲的神经纤维组成，它的神经纤维密度小于角膜外周，而且从解剖学角度而言更简单[8]。

国内外眼科学者对人角膜基质神经束定量分析进行了大量的研究[4]。Al-Aqaba 等[9]报道人类角膜基质存在44根神经束，而Marfurt等[10]则发现人类角膜基质有71根神经束。Oliveira-Soto等[7]使用狭缝扫描共聚焦显微镜观察角膜基质发现，基质中间和前部的神经密度分别是 3.7 mm·mm－2和4.2 mm·mm－2。但是另有文献报道，基质中间和前部的神经密度分别是 0.31 mm·mm－2[11]和 0.45 mm·mm－2[12]。由此可见，角膜基质神经的数目和密度仍存在争议。

2.2 上皮下丛 上皮下丛位于角膜前弹力层和基质前部的交界处[3]，主要由直的或弯曲的神经纤维和多弯拐神经纤维构成[8]。第一类神经纤维的直径为(4.09 ±2.15)μm[8]，其中大多数会穿过前弹力层到达角膜上皮，形成一部分基质浅层;另一部分基质浅层则起源于多弯拐的上皮下丛神经纤维的远端末梢。通常位于角膜不同位置的多弯拐神经纤维的密度和形态都具有很大的差异，因此不难理解角膜外周的上皮下丛神经纤维的密度高于角膜中央。Stachs等[13]使用共聚焦显微镜得到了简明的三维角膜前部的重构图，能够清楚看见上皮下的神经丛。

2.3 前弹力层 无论是基质神经纤维还是上皮下丛神经纤维，它们进入角膜上皮都必须经过前弹力层。猴的角膜神经纤维只能在角膜周围区域穿过前界层进入上皮。神经纤维进入上皮后，大的神经束分支成若干更小的神经束，而小的神经纤维则急剧旋转90°或更大的角度，平行于角膜表面分布[1]。但是，人的角膜神经纤维可从角膜外周和中央穿过前界层到达上皮，不同位置的角膜神经渗透位点的密度会有所差异。统计发现，有(204±59)根上皮下丛的神经纤维穿过前弹力层到达角膜中央直径为10 mm的区域，即神经渗透位点的密度是 2.60 mm－2[10]。角膜外周(距角膜顶部3～5 mm 的区域)神经渗透位点的密度是3.18 mm－2，是角膜中央(距中央的0～3 mm的区域)的2倍[8]。

2.4 基质浅丛 基质浅丛位于前界层和基底上皮之间，包括直的和串珠状的神经纤维，而且串珠状的神经纤维通常位于神经束的外周[3]。来自同一基质神经的一类基质浅丛被称为“上皮索(epithelial leash)”。角膜不同部位的上皮索的密度有所差异，角膜外周的上皮索的密度低于角膜中央。使用共聚焦显微镜观察人角膜时发现，人类角膜的基底上皮索的去向不同于其他的哺乳动物[1]。

观察整个基底浅丛可见，一些长且弯曲的基底神经纤维渐渐向角膜中央前行，最终构成一个螺旋状集合[8]。人角膜的基底神经旋涡结构的地理中心距角膜中央的距离为(2.51±0.23)mm，偏向鼻下方[8]。角膜基底神经纤维的长度不一，最短的基底神经纤维长度不超过1 mm，主要集中在旋涡中心附近;最长的基底神经纤维集中于角膜的上部，长度为6.5～8.0 mm 或更长[8]。研究证实，角膜上皮基底神经密度与年龄没有相关性[4]。

2.5 上皮的神经 角膜上皮的神经分别来自角膜缘表面和结膜下的神经网络。上皮神经包括基底下神经纤维和神经末梢。其中，上皮内的神经末梢与角膜敏感度具有密切的关系。上皮内的神经末梢均来自基底下的神经分支，它们分布于上皮的各层，而且它们的长度、主要去向和形态学的复杂性各不相同。研究发现，上皮神经密度与性别无关，但与年龄有关。人角膜上皮的神经末梢会随着年龄的增长而减少，但是基底下神经纤维密度随年龄的变化仍存在争议[4]。

3 角膜神经的再生

角膜神经属于外周神经，具有再生能力。然而，通常角膜的神经再生是不完全的。角膜神经的再生方式有两种:一种是由伤口周围未受损的神经和伤口内再生的实质层神经出芽再生，另一种是由伤口周围粗的神经干相继发出细的和中等粗的神经纤维，这是一种实质层和上皮下神经的真正再生[14]。有学者发现角膜神经再生分为两个时期，首先创伤区内的所有神经在短期内发生变性，同时可见来自伤口周围完整上皮下丛的粗大而且密集的神经轴索，垂直于伤口边缘走行;其次是伤口极向轴索的变性与第二代轴索的出现，这些轴索来自伤口边缘或近伤口边缘的再生的上皮下轴索[14]。

近几年，术后角膜神经的修复成为了热点。神经生长因子作为一种神经营养因子及免疫调节因子，在感觉神经元的存活、生长、分化以及促进创伤修复中发挥着十分重要的作用，可促进角膜神经的再生[5]。研究证明，无论什么物种，穿透性角膜移植术后的神经再生都非常缓慢，且角膜知觉很难完全恢复。准分子激光原位角膜磨镶术是目前最常用的近视激光矫正手术之一。业已证实，术后5 a内基质神经的再生是不完全的，而且角膜中央的敏感性与基质神经的形态学[15]和密度[16]存在着密切的关系。Darwish等[17]发现准分子激光原位角膜磨镶术和准分子激光上皮下角膜磨镶术后的任何时段，基质神经的参数都没有显著差异。但是，Lee等[16]报道准分子激光上皮下角膜磨镶术术后的基质层神经的再生比准分子激光原位角膜磨镶术快。因此，这两种手术后基质神经的再生速度是否一样还需要进一步确认。可以确定的是，在准分子激光角膜切削术后5 a，角膜中央基质层神经纤维的数目与正常的一样，并且其分支模式大致与未接受手术的正常个体相同[18]。

4 角膜神经及其相关疾病的研究

4.1 角膜炎 角膜炎分为溃疡性角膜炎和非溃疡性角膜炎两类。研究证实，患有角膜炎的角膜中央基质层神经的密度明显低于正常角膜[19]。角膜炎存在明显的角膜基质神经构造异常。其异常表现为:在角膜顶部可见一个由神经纤维束构成的多弯拐的网状结构，而且这些神经束会形成闭环;在角膜地形学的基底，神经纤维束沿着基底迁移，并且在此区域的许多神经束都偏向同一个中心[19]。使用共聚焦显微镜观察感染性角膜炎患者时发现，角膜中央上皮树突状细胞的密度与数目均增加，而且其形态发生改变，但是角膜基底下神经却明显减少了[20]。角膜炎中比较常见的是单纯疱疹性角膜炎(herpes simplex keratitis，HSK)。文献报道，兔角膜接种HSVⅠ3 d后，角膜上皮下感觉神经丛出现散在分布的末梢神经溃变，上皮基底索轴突肿胀和断裂，随着病程的进展，神经病变继续加重，但在感染后28 d，光镜下可以见到神经纤维以芽生方式再生。Rosenberg等[10]利用共聚焦显微镜，对16眼尚未出现树突状角膜溃疡的病程在1～12个月的HSK患者进行角膜神经的研究，结果发现2眼出现角膜上皮细胞变大，2眼上皮下神经丛缺失，3眼长神经丛数量明显减少。最近研究显示，使用活体内共聚焦显微镜观察HSK患者角膜时发现，上皮和基质的HSK间歇性发作会渐渐破坏角膜上皮下神经旋涡结构的形态。但是，内皮的HSK却不会对角膜上皮下神经旋涡结构的形态产生影响[21]。

4.2 干眼征 任何降低泪膜(质或量)的因素都可造成干眼征发生。干眼征主要包括水液缺乏型干眼和非水液缺乏型干眼两种类型。与正常人群对比，两种类型干眼征都可伴随角膜基质神经密度下降[11]或者不改变[22]。另外，干眼病患者的角膜神经呈现不正常的形态改变，这在干燥综合征患者中表现更明显，最直观的改变是角膜神经数量、弯曲度、神经分支的增加[23]。其原因可能与应激状态下由炎症细胞分泌过多神经生长因子的刺激有关[24]。但是，角膜神经形态的改变可能不会造成角膜敏感度的降低[22]。

4.3 糖尿病 糖尿病是一种系统性代谢性疾病，可累及全身各个器官，也可引起角膜神经的异常。糖尿病性神经病变是最普遍的、花费最多的糖尿病性并发症。高达50%的糖尿病患者都有并发症，其中糖尿病多发神经病变是一种常见的并发症。在糖尿病兔模型中，发现角膜肾上腺素能神经在角膜缘形成的神经网丛密度稀疏，行向角膜浅基质层的神经分支变细。发病6周时，电镜下发现角膜神经轴突水肿，神经纤维分布稀疏不均，有些线粒体呈空泡变性，有些则固缩呈颗粒状。发病12周，神经轴突则呈现高度水肿，甚至崩解，线粒体也因水肿严重而破裂[25]。Rosenberg 等[26]在共聚焦显微镜下发现，糖尿病患者的基质神经纤维束数量显著降低，且角膜敏感性也显著下降。研究证实，与正常角膜相比较，糖尿病患者的神经纤维密度、长度和分支密度都明显降低[27]。Chang 等[28]使用了一个新的方法来定量分析糖尿病患者基质神经纤维的弯曲度，发现周围神经病变越严重，患者角膜基质神经纤维的弯曲度就越大。就目前而言，共聚焦显微镜是监控人类糖尿病患者角膜神经病变的最佳检测和评估工具[29]。

5 结论

虽然对角膜神经的深入研究解决了部分角膜神经相关疾病的预防与治疗工作，但是，仍有许多问题尚待解决，如哪些疾病与角膜神经形态和数量具有相关性，如何改善术后角膜神经的再生等。

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