TopBP1在DNA损伤修复及乳腺癌发生中的作用

汪海新 应明真 王 梅

一、概 述

人类DNA拓扑异构酶Ⅱβ结合蛋白1(DNAtopoisomeraseⅡβ－bindingprotein1，TopBP1)是最初于1997年由Yamane等人经双杂交筛选分离得到的一种能结合到DNA拓扑异构酶Ⅱβ蛋白C末端区域的蛋白［1］。TopBP1基因定位于人类染色体3q22.1，含29个外显子，编码的TopBP1蛋白含1522个氨基酸，分子质量180kDa。人类TopBP1蛋白的同系物包括爪蟾的Xcut5/Xmus101，果蝇的Mus101，线虫的MUS－101，拟南芥的Mei1，啤酒酵母的Dpb11，裂殖酵母的Cut5/Rad4等［2］。

TopBP1与乳腺癌易感基因1蛋白(breastcancer susceptibilitygene1，Brca1)存在结构上的同源性，表现在TopBP1蛋白包含8个Brca1羧基末端(brca1 carboxyterminus，BRCT)功能域。BRCT功能域能够和其他的BRCT功能域、非BRCT功能域，以及DNA链断裂区域结合，在DNA损伤修复和细胞周期调控中发挥作用［3］。低等真核生物和酵母的TopBP1同系物较脊椎动物的TopBP1蛋白要小很多，比如果蝇、线虫和酵母的TopBP1同系物就分别有7个、6个和4个BRCT功能域，表明这些功能域在生物体进化过程中逐渐产生并增加了不同的功能［4］。TopBP1能与多种蛋白相互作用且有特定的结合区域，例如TopBP1与多聚ADP核糖聚合酶1［poly(ADP－ribose)polymerase－1，PARP－1］的自动ADP核糖基化位点有序列同源性，这两种蛋白的相互作用依赖于TopBP1的第6BRCT功能域［5］。

DNA双链断裂(DNAdouble－strandbreak，DSB)是最严重的DNA损伤，哺乳动物细胞DNA修复基因或蛋白表达异常造成修复能力下降或缺乏可导致基因组不稳定以及肿瘤的发生［6］。TopBP1是一种重要的蛋白，在维持基因组稳定性方面有多种功能，本文就TopBP1蛋白在DNA损伤修复及乳腺癌发生中的作用做一综述。

二、TopBP1参与DNA损伤反应

真核细胞基因组经常面临因暴露于外源性或内源性DNA损伤因子而导致的基因突变压力，在S期更易出现DNA断裂，若不能修复或不正确修复，对细胞活性和基因组稳定性将产生严重威胁。DNA双链断裂主要通过同源重组(homologousrecombination，HR)及非同源末端连接(nonhomologousendjoining，NHEJ)途径修复。围绕这些修复通路，哺乳动物产生DNA损伤反应(DNAdamageresponse，DDR)，其作用是察觉DNA损伤和激活信号传导级联，用以启动损伤修复及阻滞细胞周期直至修复完成［7］。TopBP1具有与多种DNA损伤反应蛋白相互作用的能力，参与DNA损伤反应过程。

真核细胞DNA双链断裂后通过信号转导通路而激活DNA修复过程及细胞周期检查点。在高等真核细胞，染色质DNA双链断裂迅速启动组蛋白变异体H2AX在139位丝氨酸位点磷酸化，形成γH2AX，并以此作为DNA损伤引发信号级联反应核心组分的聚集场所，因而γH2AX的形成被认为是DNA双链断裂损伤的标志。γH2AX的磷酸化过程需要磷酸肌醇3－激酶相关激酶(phosphoinositide3－kinaserelated kinases，PIKK)家族成员毛细血管扩张症突变蛋白(ataxiatelangiectasiamutated，ATM)、ATM与Rad3相关蛋白(ATMandRad3related，ATR)和DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位(DNAdependentproteinkinase catalyticsubunit，DNA－PKcs)的激活，其中以ATM为主［8］。γH2AX形成后随即招募其他DNA损伤反应蛋白，包括 Nijmegen断裂综合征蛋白1(Nijmegen breakagesyndrome1，Nbs1)、P53结合蛋白 1(P53 bindingprotein1，53BP1)、DNA损伤检查点蛋白调节子1(mediatorofDNAdamagecheckpointprotein1，MDC1)和TopBP1等。在DNA损伤反应中Mre11－Rad50－Nbs1(MRN)复合体有助于TopBP1与ATM相联系，而TopBP1的第1、2BRCT功能域能与MRN复合体中Nbs1亚单位相互作用，维持DNA双链断裂后正常的检查点功能［9］。免疫共沉淀 TopBP1和53BP1提示这两个蛋白能够物理接触且相互作用。在DNA双链断裂时，TopBP1和53BP1共定位于DNA损伤位点，TopBP1的第4、5BRCT功能域与53BP1相互作用，在G1期介导53BP1的检查点功能［10］。MDC1是细胞应对DNA双链断裂的重要检查点蛋白，Wang等［11］研究发现TopBP1与MDC1在控制DNA复制检查点方面有功能相关性。特异性TopBP1－MDC1相互作用是由TopBP1的第5BRCT功能域与MDC1的丝氨酸－天冬氨酸－苏氨酸残基重复序列介导，从而DNA双链断裂信号经H2AX/ MDC1级联转导放大后，使TopBP1聚集于阻滞的复制叉。TopBP1与这些蛋白之间的生物学行为上调和稳定了TopBP1和γH2AX的共定位效应，从而也证明TopBP1参与DNA损伤反应过程。

作为多功能肿瘤抑制因子的早幼粒细胞白血病蛋白(promyelocyticleukemiaprotein，PML)在DNA双链断裂同源重组修复中对Rad51、Mre11、Brca1蛋白的聚集和定位都有作用，而 PML过表达有稳定TopBP1的作用［12］。Morishima等［13］在用siRNA沉默TopBP1后，发现细胞对丝裂霉素C和电离辐射敏感性增加，自发性或丝裂霉素C诱导性的姐妹染色单体互换水平下降，且经TopBP1siRNA转染的细胞同源重组修复较正常对照细胞下降2倍。从而说明TopBP1在DNA双链断裂同源重组修复中发挥重要作用。

三、TopBP1是ATR－Chk1通路的介导蛋白

在DNA损伤反应的顶点发挥调节作用的蛋白激酶ATM、ATR和DNA－PKcs都属于PIKK激酶家族，能够探查到损伤的DNA、阻滞的复制叉或DNA修复的中间体。DNA双链断裂激活ATM和DNA－PKcs，而DNA双链断裂、复制应激、碱基加合物及DNA链交联均可激活ATR［14］。ATR被激活后可使下游众多底物磷酸化，其中最重要的是检查点激酶蛋白1 (checkpointkinaseprotein1，Chk1)的磷酸化，使得DNA损伤信号进一步转导到p53、Cdc25A、Cdc25C等，从而在DNA损伤后复制起始、复制叉稳定性、细胞周期检查点和DNA修复方面发挥重要的生物学效应［15］。ATR是细胞生存所必需的，功能上相当于DNA损伤反应的主调节器，因而ATR－Chk1通路是DNA损伤反应中的重要通路。

ATR能被多种DNA损害所激活，而通用的刺激信号是在DNA损伤和复制应激过程中产生的单链DNA(single－strandDNA，ssDNA)。由于伸展的ssDNA对细胞是有害的，因而迅速被复制蛋白A(replicationproteinA，RPA)包裹。保守的ATR－Chk1通路中，ATR通过其重要结合伴侣ATR相互作用蛋白(ATRinteractingprotein，ATRIP)被招募于RPA－ss-DNA，9－1－1检查点钳(Rad9－Rad1－Hus1checkpointclamp)结合在DNA断裂双链和单链的连接处并招募介导蛋白TopBP1，介导蛋白Claspin招募Chk1到DNA损伤位点从而使ATR能得以直接磷酸化Chk1，而TopBP1与ATR－ATRIP复合体及9－1－1检查点钳中Rad9发生相互作用。ATR－ATRIP的完全激活不能由 RPA－ssDNA单独实现，还需要TopBP1的参与。

Kumagai等在体外实验中发现TopBP1极大的增强ATR激酶活性。他们发现TopBP1与ATR－ATRIP复合体发生作用，TopBP1的ATR激活区(ATR－activatingdomain，AAD)位于第6、7BRCT功能域之间，AAD区本身足以异位激活ATR依赖性信号转导，而AAD区的单点突变即可使这一活性消失。Toledo等实验也证实，将异位表达的AAD区从胞质重置于胞核后足以激活ATR，在无DNA损伤的前提下过表达AAD区能够激活ATR而促进Chk1、H2AX、Rad17等底物的磷酸化。而Liu等实验发现下调TopBP1阻止了ATR激酶对Chk1、Nbs1、H2AX等底物的磷酸化。因此，TopBP1激活ATR似乎是自然界的普遍现象，ATR使众多底物磷酸化的活性需要TopBP1来充分激活。

TopBP1激活ATR－ATRIP的具体机制尚不明确，一个可能机制是TopBP1类似于一个支架，联系众多蛋白聚集在ATR附近而被ATR磷酸化;另一可能机制是蛋白的共定位易化了TopBP1和ATRIP的相互作用，这使得TopBP1的AAD区能够接触ATR，诱导了ATR激酶区构象的改变，因而底物能够被轻易磷酸化，也就是说结合TopBP1后ATR－ATRIP构象改变而促进激活［4］。TopBP1和ATR－ATRIP之间的相互作用是松散而短暂的，无TopBP1存在时ATR只有基本的激酶活性，只有在TopBP1结合以后ATR－ATRIP才是有活性的。经凝胶过滤使TopBP1从复合体分离以后，ATR－ATRIP激酶活性又恢复到初始的较低水平［18］。TopBP1对ATR的有效激活，是细胞为了充分应对DNA损伤反应而进行信号放大的需要。

TopBP1和ATRIP的接触易化了TopBP1和ATR之间的相互作用。TopBP1发生在ATRIP接触区的突变削弱了细胞从复制应激状态中恢复及诱导细胞周期阻滞的能力，从而使细胞活性下降。TopBP1与ATR的C末端上的特异性PIKK调节区相互联系，发生在ATR调节区的突变不影响基本的激酶活性，但阻止了激酶的完全激活。ATR强力激活需要1989位苏氨酸的自磷酸化，它反式发生于聚集在RPA－ssDNA的ATR－ATRIP复合体。自磷酸化的1989位苏氨酸能被TopBP1直接识别，使TopBP1能够稳定连接到ATR－ATRIP复合体、有效刺激ATR激酶及起到ATR与底物联系的支架作用。因此DNA损伤导致的ATR的完全激活需要RPA－ssDNA、ATR自磷酸化和TopBP1的连续性驱动。

四、TopBP1在DNA损伤修复中的活性调节

由于与TopBP1的接触可触发ATR的激活，所以细胞中这两种蛋白的相互作用时机就需要严密控制。9－1－1检查点钳能够调节TopBP1与ATR的接触，经387位丝氨酸磷酸化后Rad9结合TopBP1的第2BRCT功能域并将其引导到ATR－ATRIP的周围。细胞中TopBP1对ATR的激活刺激也依赖于TopBP1结合到损伤的DNA模板，Choi等研究显示TopBP1是通过其C末端，包括AAD区和第7、8BRCT功能域来结合DNA的。

DNA损伤反应中 TopBP1非常早就被招募到DNA损伤位点，并激活ATR激酶作用到几乎所有ATR靶点。现已明确在激活ATR方面并不要求对TopBP1蛋白进行转录后修饰，因为这种激活也发生在TopBP1重组体或单独AAD区。但是对于TopBP1蛋白定位区域和(或)浓度的不同，也可视为一种修饰调节。异位表达的AAD区会缺乏任何DNA结合活性，但当将其从胞质移至胞核后，又能够激活ATR。所以，在正常细胞环境中，控制ATR的激活，可以通过调节TopBP1的定位而实现，或许也能通过调节溶解蛋白的浓度而实现。

在招募TopBP1到DNA损伤位点时存在多层控制机制:①TopBP1能被信号识别蛋白，如Rad9招募到激活位点;②早期结合到DNA损伤位点的Nbs1、53BP1、PARP－1都可能再与TopBP1结合，从而为TopBP1结合到损伤位点提供新途径;③体外实验也见TopBP1直接结合到诸如DNA断裂、单链DNA或大量加合物的DNA损害处［4］。这种招募TopBP1的冗繁机制是生物体逐渐进化中形成的，从而保证当基因组遇险时维护基因组保真度的通路能有效激活。

五、TopBP1与乳腺癌的发生

DNA损伤诱导的DNA修复和细胞周期检查点功能在抑制肿瘤发生方面有重要意义，特别是在ATR－Chk1通路上的蛋白出现功能异常后将促进恶性肿瘤的发生发展。有致癌作用的雌二醇E2和膜相关雌激素受体α(estrogenreceptorα，ERα)内源性抑制了ATR级联转导信号引发的G2/M检查点和快速DNA修复功能，因而更易促进乳腺癌的发生。由于TopBP1蛋白在细胞维持基因组稳定性，特别是DNA损伤修复中起重要作用，所以TopBP1基因变异导致的TopBP1功能异常也可能会增加乳腺癌的发病风险。

Karppinen等在芬兰125个家族性乳腺癌和卵巢癌群体中筛查胚系TopBP1基因突变，发现杂合子Arg309Cys错义突变发生频率较健康对照组高，两者有明显的差异(15.2%vs7.0%，P=0.002)。这种变异发生在TopBP1蛋白N末端接近第2BRCT功能域的进化保守序列区，与大约2倍的乳腺和(或)卵巢癌风险增高有关。但随后Blaut等在德国的调查研究认为TopBP1基因Arg309Cys变异并没有增加德国人患乳腺癌的风险。因而TopBP1基因多态性导致乳腺癌方面也存在争议，这方面的研究还需在更大范围及更多人种间进行。

组织学研究支持TopBP1蛋白在抑制乳腺癌方面的潜在作用。Going等在未经选择的乳腺癌组织中发现TopBP1蛋白的异常表达:在普通乳腺组织中TopBP1蛋白主要定位于细胞核，而在乳腺癌中表达方式多种多样，既有核染色、核浆同时染色，又有单纯胞质染色。类似的结果也分别见于猫科和犬科动物乳腺肿瘤中。既然乳腺癌组织中大多数的TopBP1过表达发生在胞核，TopBP1因此能影响转录因子如E2F1、p53等的功能。

肿瘤抑制因子p53蛋白在应对DNA损伤时控制G1/S检查点而使细胞周期阻滞于G1期，而在非应激状态下p53活性应维持在较低水平以利于细胞正常增殖。大多数人类肿瘤中p53是突变或失活的。Liu等研究发现TopBP1的缺失上调了涉及细胞周期阻滞和凋亡的p53靶基因的活性，这种调节由TopBP1的第7、8BRCT功能域和p53的DNA结合区介导，抑制了p53的启动子结合活性。他们的研究显示TopBP1的过表达更易在三阴性乳腺癌中见到，且与较高肿瘤分级和较短生存时间相关。TopBP1过表达抑制了p53靶基因的表达，抑制了DNA损伤引发的细胞凋亡和G1期阻滞。因此，生理水平的TopBP1对正常G1/S期转换是必要的，而肿瘤细胞中病理水平的TopBP1可能会扰乱p53功能而使肿瘤表现出侵袭性。

六、展 望

DNA双链断裂引发的染色体不稳定促使肿瘤易感性增加，修复过程错误是有丝分裂的生长细胞产生染色体畸变的主要来源，这就要求有复杂的监督机制来保证正确的DNA修复重建。TopBP1是重要的蛋白，除参与DNA损伤信号转导、细胞周期检查点控制及DNA修复功能外，还在DNA复制、转录及细胞分裂方面发挥作用，因而涉及细胞增殖和凋亡。TopBP1的过表达与侵袭性乳腺癌相关，因而具有治疗意义，如将特异性的TopBP1抑制剂用于那些高表达TopBP1的乳腺癌患者，以重新激活p53依赖性的凋亡而增加疗效。随着研究的不断深入，针对TopBP1这一重要的DNA损伤修复蛋白的靶向药物有望研制成功，个体化的肿瘤预防和治疗手段也将在临床工作中逐步得到应用。

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