转化生长因子－β激活激酶1在NF－κB信号通路中的作用及临床意义

邵天伟 梁小明 陈昌辉

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)级联是真核生物信号传递网络中的重要途径之一。MAPK链由3类蛋白激酶(MAP3KMAP2K－MAPK)组成。转化生长因子－β激活激酶1(transforming growth factor－βactivated kinase－1，TAK1)是MAP3K家族的主要成员，具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性，是NF－κB信号通路中的重要调节因子，在炎症基因表达中起着关键性的调节作用［1］。TAK1作为通路中的上游信号分子，可以使IκB激酶(IκB kinase，IKK)磷酸化，活化NF－κB，触发下游的NF－κB级联反应［2］。

NF－κB信号通路在多种细胞中都有表达，且在多种病理生理过程(包括炎症、免疫、细胞凋亡等)中发挥作用［3～5］;NF－κB的异常活化与多种疾病的发生、发展及转归密切相关。现就TAK1激活NF－κB信号通路的研究进展及临床意义进行阐述。

一、TAK 1的结构和生物学作用

1.TAK1的结构:TAK1为单跨膜蛋白，具有保守的激酶活性域、疏水性强的N端跨越类囊体膜，处于基质中的亲水性C端结构。TAK1蛋白含有9个α－螺旋和18个β－折叠，无规卷曲约占57%，在第168～190位点存在一个ATP结合域，第162～440位点为激酶功能域。TAK1 激酶活性区是VVHRDIKSSNILL(285～297)，具有典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的特点，第289位的天冬氨酸(Asp，D)是激活丝氨酸－苏氨酸羟基的催化残基，即活性位点［6］。TAK1是NF－κB经典信号通路中的调节蛋白，其激活NF－κB的磷酸化位点为苏氨酸(Thr)－184位和Thr－187位［7］。

2.TAK1的生物学作用:TAK1在固有免疫和适应性免疫中均发挥关键作用［8］。Vidal等［9］研究dTAK1基因突变的果蝇时发现，TAK1基因突变的果蝇虽然能够生存和繁殖，但其产生抗菌肽的能力消失，对革兰阴性菌高度易感。表明TAK1在固有免疫介导NF－κB信号通路中具有重要作用。促炎因子(如TNF和 IL－1β)主要诱导固有免疫反应［10］。Map3k7基因负责编码TAK1的激酶结构的一部分，包括ATP的催化位点(Lys63)。Takaesu等［2］通过RNA干扰使Hela细胞中的TAK1(Lys63)基因位点突变，再用IL－1β和TNF刺激Hela细胞，Hela细胞的NF－κB信号转导则不能被激活。Sato等［8］通过杂交建立 Map3k7基因缺陷小鼠模型，用于研究TAK1在体内外的功能，发现杂交得到的Map3k7－/－基因型的小鼠在子宫内即已死亡。从胚胎期死亡的Map3k7－/－小鼠的胚芽中分离出小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)，再用TNF及IL－1β刺激TAK1缺陷的MEFs，这种细胞的TAK1由于缺乏ATP结合位点而丧失功能，MEFs的NF－κB信号通路则不能被激活。表明TAK1在IL－1β和TNF诱导的NF－κB和JNK激活及细胞因子的产生过程中是必需的。进一步研究显示，TAK1缺乏的B细胞存在NF－κB基因及NF－κB靶基因表达缺陷;当B细胞受到脂多糖(LPS)和磷酸胞苷酰(CpG)等刺激时，JNK和NF－κB通路不能被激活。说明在激活B细胞受体(B－cell receptor，BCR)介导的信号通路中也需要TAK1参与。当刺激TAK1基因缺陷的B细胞时，除IgM以外，其他血清免疫球蛋白表达都减少。Sato等［11］随后在构建的T细胞TAK1基因缺陷小鼠模型中发现，TAK1在T细胞受体(T－cell receptor，TCR)介导NF－κB活化及MAPKs活化、T细胞成熟、T细胞增殖中都起着关键性的作用。研究显示，应用TAK1的抑制剂能够明显抑制T细胞分泌IL－2［12］，表明TAK1作为一种激酶，可以调节炎性反应。由此可见，TAK1在免疫调节中发挥着重要的生物学作用。

二、TAK 1在激活NF－κB信号通路中的作用

没有外界刺激时，NF－κB杂二聚体与其抑制蛋白IκB位于细胞质中，呈无活性状态。当各种刺激因子(如脂多糖、病毒蛋白、氧自由基、细胞因子等)刺激细胞时，细胞内信号物质聚集，多种蛋白激酶被磷酸化，进而将刺激信号传递给TAK1;活化的TAK1能够使IKKβ的丝氨酸(Ser)－177和Ser－181位磷酸化并激活IκB激酶(IκB kinase，IKK)复合物，促进IκB蛋白降解，去除IκB的抑制作用后，NF－κB才能进入细胞核调节特异基因的转录表达［13，14］。TAK1可经多种途径激活NF－κB信号通路。

1.TAK1经肿瘤坏死因子受体(TNFR)激活NF－κB信号通路:免疫细胞受TNF－α刺激时，首先配体与TNFR结合，招募死亡区肿瘤坏死因子受体1相关蛋白(TNF receptor 1 associated via death domain，TRADD)、肿瘤坏死因子相关因子2(tumor necrosis factor receptor－associated factor，TRAF2)、肿瘤坏死因子相关因子5(TRAF5)及受体相互作用蛋白1(receptor－interacting protein 1，RIP1)等受体相关复合物，再由赖氨酸63偶联的多聚泛素链(Lys63－linked polyubiquitination)使TRAF2和RIP1泛素化(ubiquitination)，最后 RIP1与 BC13/UEV1A泛素活化酶(ubiquitin－activating enzyme，E1)催化聚泛素化复合蛋白体生成。聚泛素化复合蛋白体则能够通过泛素蛋白结合TAB2/TAB3与NEMO(IKK的基本调节亚单位［由IKKr亚单位和IKK激酶组成］)。NEMO亚单位招募TAK1和IKK，二者结合后IKK被TAK1活化，进而使NF－κB活化［15］。在新生鼠缺氧性脑损伤动物模型中，当TNF－R1表达增多时，可加速神经细胞的死亡;TNF－R2表达增多时，TAK1表达也增多，则促进神经细胞的再生，对脑损伤的恢复起促进作用。Nijboer等［16］研究表明，在脑损伤发病及其过程恢复中TAK1表达均增加。

2.TAK1经IL－1R/TLR激活NF－κB信号通路:IL－1β或LPS分别与各自的受体IL－1R、TLR结合，进而赖氨酸63偶联的多聚泛素链TRAF6与白介素－1受体相关激酶家族(IRAKs)结合，再募集髓样分化因子 88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)，使IRAK1与IRAK4结合，IRAK4可磷酸化并激活IRAK1，磷酸化的IRAK1结合并活化TRAF6，然后TRAF6与UBC13/UEV1A E1一起催化聚泛素化复合蛋白体的生成，经与TNFR同样的方式连接TAB2/TAB3与NEMO，激活TAK1［17～19］，最后TAK1活化NF－κB和AP－1，从而调节多种效应基因的表达(如炎症因子、化学增活素、黏附分子和蛋白水解酶)［20］。骨性关节炎患者的关节软骨中TAK1 mRNA表达量与正常人相比明显减少，骨性关节炎的发病与TAK1的减少相关。用 IL－1β孵育人软骨肉瘤SW1353细胞株时，TAK1蛋白表达减少，间质金属蛋白酶(MMP)1、MMP13及TNFa的表达也减少。表明TAK1与肿瘤的转移有密切关系。

3.TAK1经BCR/TCR激活NF－κB信号通路:除上述两种途径外，刺激BCR/TCR也可经赖氨酸63偶联的多聚泛素链使TRAF2和TRAF6泛素化，以相似的方式激活B细胞及T细胞中的NF－κB。蛋白激酶C(protein kinase PKC，PKC)属于丝氨酸－苏氨酸激酶(serine－threonine kinase);PKCβ和PKCθ分别在BCR和TCR通路中起作用。最初，结合了配体的BCR/TCR复合体会启动酪氨酸磷酸化级联反应，激活PKCβ/θ。然后，PKCβ/θ激酶能诱导半胱天冬氨酸募集区域膜相关鸟苷酸激酶蛋白1－淋巴瘤凋亡抑制基因10－黏膜相关淋巴瘤异位基因1(CARMA1－Bcl10－MALT1，CBM)复合体的形成。CBM复合体中的MALT1蛋白含有能与TRAF2和TRAF6结合的结构域，能将TRAF6招募至CBM复合体，通过促进TRAF6的寡聚化作用激活泛素－蛋白连接酶3 (ubiquitin－protein ligatillg enzymes，E3s)。目前已经发现多种TRAF6蛋白的靶蛋白(如BCL10、MALT1、NEMO以及TRAF6蛋白自身)。最后，在BCR/TCR信号刺激作用下，这些靶蛋白经多泛素化修饰后都有可能被招募并激活TAK1－IKK复合体。Sato等［11］研究发现，T细胞Tak1基因缺陷鼠出生后前3个月是正常的，4～6个月后开始出现腹泻。腹泻小鼠有结肠僵硬、结肠脱垂、脾大等现象。组织学研究显示，这些小鼠的结肠出现溃疡、上皮层杯状细胞消失及单核细胞浸润。无TAK1基因缺陷的对照组小鼠则无此现象。进一步研究发现，TAK1基因缺陷小鼠胸腺中的调节性T细胞数目缺失。因而推测通过对TAK1进行干预，增加调节性 T细胞的数目，将能预防TAK1缺陷引起的自发性结肠炎。

三、TAK1与疾病的关系

1.感染性疾病与TAK1:临床上，新生儿易患感染性疾病。固有免疫在新生儿免疫防御中发挥重要作用。由于未经过抗原刺激，新生儿的适应性免疫细胞缺乏记忆，尚不成熟，处于暂时性T细胞介导的免疫功能低下状态，有待以后发育完善。所以，新生儿患严重的病毒感染和真菌感染的风险较高;体内使细菌感染局限化的能力较弱，感染容易全身扩散。Liu等研究发现，T细胞特异性缺乏TAK1会影响CD4+和CD8+SP胸腺细胞的发育，导致外周血、淋巴结和脾脏等周围组织中的T细胞明显减少。推测TAK1与新生个体的固有免疫与适应性免疫的发育密切相关。TAK1的表达缺陷可能导致在新生儿期对病原体感染无应答。同时，适应性免疫在机体发育过程中也不能建立完善。研究表明，TAK1基因突变的果蝇固有免疫功能受损［9］;TAK1缺乏小鼠的细胞免疫及体液免疫受损［8，11］。福氏志贺菌Ⅲ型能够分泌具有磷酸苏氨酸裂解酶活性的效应因子OspF。OspF可以使受感染上皮细胞的MAPKs p38不可逆地脱磷酸化，抑制p38的表达。p38能负反馈调节TAK1的表达。感染福氏志贺菌Ⅲ型的小鼠上皮细胞p38表达减少，使TAK1无限制被活化，导致NF－κB信号通路过度激活。NF－κB的激活会使机体发生免疫反应，对感染产生应答。但NF－κB无限制地被激活，会使炎症反应增强，也可能使炎症细胞凋亡，或使免疫细胞处于功能的沉默状态，从而影响机体对细菌感染的局限能力。

许多感染性疾病对机体造成损害的机制与TAK1上调炎症反应基因有关。流感嗜血杆菌(nontypeable hemophilus influenzae，NTHi)是儿童和成人的常见病原体之一。NTHi容易引起儿童中耳炎，是导致传导性耳聋的重要原因。感染NTHi后，TAK1表达增多，IKKβ的激活被上调，IKKβ加速IKBa的分解，IKBa的减少造成NF－κB过度活化，分泌的IL－1β、IL－8、TNF等炎性因子增多，导致中耳内皮细胞受损;增多的炎性因子又可进一步激活NF－κB，使炎症反应被放大。呼吸道合胞病毒(RSV)是婴儿及儿童流行性呼吸道疾病的常见致病病原体。RSV感染呼吸道上皮细胞，引起免疫及炎症反应。抑制TAK1可以减少RSV感染引起的炎症反应，减轻对机体造成的损伤。适当调节TAK1的表达，使机体产生适当的炎性反应，机体既能对感染产生应答，又不造成免疫过强性损伤。

2.缺氧性脑损伤与TAK1:研究表明，炎症在大脑的局部缺血性损伤中起着重要的作用。啮齿类动物缺氧1h后，缺氧区域TNF－αmRNA表达增多;缺氧2～6h后，TNF－α蛋白即有表达。TNF－α及促凝素可以损伤内皮细胞加重脑再灌注损伤。新生鼠缺氧缺血性脑病模型的脑组织有暂时性IL－1βmRNA和TNF－αmRNA的表达增多。IL－1β、TNF－α等致炎因子增加可通过上述3种途径来激活TAK1，使NF－κB通路活化，造成神经酰胺的积聚，最终引起神经细胞凋亡。当缺氧时，新生大鼠脑组织TAK1表达增多，NF－κB被激活，TNFa mRNA及蛋白量表达增多;当TAK1分解增多时，NF－κB被抑制，脑损伤减轻。在用神经保护性药物TAT－NBD对脑损伤进行治疗时，疾病恢复过程中神经细胞TAK1总量及磷酸化TAK1表达都增加。表明TAK1通过激活NF－κB参与了缺氧性损伤;同时TAK1也参与了脑神经细胞的恢复过程，但具体机制仍不清楚，可能与TAK1激活了另外的通路有关［16］。研究发现，用TAK1的抑制剂处理缺氧脑细胞1h，能减少缺氧引起的脑细胞的凋亡;用抑制剂脑室内注射20min，可以减少中脑动脉闭塞引起的脑梗死的面积，并使小鼠脑损伤后的右旋转的行为消失。说明短时间抑制TAK1可以减少脑细胞死亡，改善感觉运动功能，对脑损伤起到保护作用。进一步研究表明，长时间抑制TAK1并不能对脑损伤起到保护作用，原因是延长对TAK1抑制的时间，则可激活细胞凋亡信号调节激酶1，对抗TAK1的抑制作用。

3.针对TAK1的靶向治疗:针对TAK1的靶向治疗，为炎症性损伤的治疗提出了新思路。靶向基因治疗是指当双链RNA被特异的核酸酶降解时，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，可使特异性酶降解靶RNA，从而抑制或下调靶基因的表达。经siRNA诱导的小鼠，出生后3周脾脏TAK1表达明显降低，NF－κB依赖的信号通路受到抑制，炎症反应减弱;关节炎小鼠模型经siRNA治疗后，全身症状得到有效缓解;siRNA处理的小鼠CD4+♂T细胞数目减少;脾细胞在接受抗原或抗CD3/CD28抗体刺激时，产生TNF－α、干扰素 －γ (IFN－γ)和白介素－17A(IL－17A)等炎性因子的能力降低。说明靶向抑制TAK1基因可起到免疫调节的作用。化学性抑制剂5Z－7－oxozeaenol通过竞争性抑制TAK1的ATP结合位点，可以在体内外选择性抑制TAK1的活性。应用5Z－7－oxozeaenol与细胞共同孵育5～10min，可明显减少内源性TAK1的生成;加大剂量至100nmol/L处理30min，清除5Z－7－oxozeaenol，抑制作用仍将持续，提示大剂量、长时间其对细胞的抑制作用是不可逆的。为了进一步证明5Z－7－oxozeaenol的体内作用，采用化学药物2，4，6－三硝基氯苯等使小鼠耳部致敏，建立环氧化酶2介导的炎性肿胀模型，测量耳的厚度作为观察指标。结果显示，给小鼠耳部应用5Z－7－oxozeaenol后，可以有效缓解其耳部肿胀症状达50%。5Z－7－oxozeaenol也可以减少缺氧性脑损伤引起的脑细胞凋亡，缓解小鼠脑损伤的症状。表明TAK1表达增多导致炎症反应过强并造成机体损伤时，靶向抑制TAK1可以减少炎症因子的释放，起到保护机体的作用。

综上所述，TAK1在NF－κB信号通路中发挥重要的调控作用，参与了多种疾病的发病过程。通过上调或抑制TAK1，可激活或阻断NF－κB信号转导，起到增强免疫应答或减少机体炎性损伤的作用。但对TAK1的干预时间及程度仍需进一步研究。

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