3种体细胞共培养体系对昆明鼠早期胚胎体外发育潜力的影响研究

李 娟 盖 凌 魏 斌 王洪岩 王磊光 邱 毅 张 琦 于小洁

山东省计划生育科研所，山东省优生重点实验室(济南，250002)

已有的研究表明，胚胎在体外培养与体内生长其形态学和发育速度均存在差异。随着培养液的不断改进，胚胎的体外发育率得到了很大提高，但目前所用的各种培养系统还不能完全模拟体内胚胎供给环境，胚胎的发育率及质量仍存在很多问题。如何改善胚胎体外生长环境，提高胚胎质量与发育潜能，一直是研究的热点。胚胎体外培养中使用共培养由来已久，先后使用过多种辅助细胞与胚胎共培养，如人及牛输卵管上皮细胞、非洲绿猴肾细胞、颗粒细胞等。但是人们对共培养的益处尚无一致意见。本研究采用人卵丘细胞、昆明鼠卵丘细胞、昆明鼠成纤维细胞等3种共培养体系与昆明鼠早期胚胎共培养，观察胚胎发育情况，筛选适宜体外培养条件，探讨早期胚胎理想生存环境。

1 材料与方法

1．1 主要试剂与仪器

1．1．1 试剂 孕马血清(宁波第二激素厂)，人绒毛膜促性腺激素(hCG，丽珠制药厂)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，DMEM培养基和胰蛋白酶(Gibco公司)，丝裂霉素 －C(Sigma公司)，透明质酸酶(Sigma公司)，IVC序贯培养液(IVC－ONE液、IVC －TWO 液、IVC，美国)，Hoechst染色试剂盒(碧云天生物技术研究所)。

1．1．2 仪器 解剖显微镜、倒置显微镜、荧光显微镜(Nikon)，二氧化碳培养箱(Galaxy)。

1．2 方法

1．2．1 人卵丘细胞共培养体系制备 人卵丘细胞取自因男方因素不育需做卵胞浆内单精子注射的女性患者，取卵后获得的卵冠丘复合体用80U/ml透明质酸酶分离卵子和卵丘细胞。收集卵子用于卵胞浆内单精子注射;卵丘细胞迅速收集在离心管中，加IVC－ONE液 4～6ml混匀，1 000rpm/min离心5min，去上清，加IVC－ONE液调密度为卵丘细胞5×104/ml，制成 50μl/滴的人卵丘细胞液滴，置37℃、CO2培养箱培养，当卵丘细胞贴壁伸展后，更换IVC－ONE液，用于共培养。

1．2．2 昆明鼠卵丘细胞共培养体系制备 昆明鼠由山东大学实验动物中心提供。选取7～8周龄阴道口呈粉红的昆明白雌性小鼠，腹腔注射孕马血清10U/只，48h后腹腔注射hCG 10U/只，并与正常雄鼠合笼(雌雄比为2:1)，12h后观察雌鼠有无阴道栓形成;断颈处死有阴道栓的小鼠，在解剖镜下剥离输卵管，用TB针剥开输卵管壶腹部，收集卵冠丘复合物，用80U/ml透明质酸酶分离受精卵和卵丘细胞。受精卵置IVC－ONE液培养至2细胞后随机分配给各共培养体系;收集卵丘细胞加培养液调密度为5 ×104/ml，制成50μl的液滴，放37℃、CO2培养箱培养，当卵丘细胞贴壁伸展后，更换IVC－ONE液，用于共培养。

1．2．3 昆明鼠成纤维细胞共培养体系制备 取孕13．5d昆明小鼠的胚胎，去除头、尾、内脏和四肢后，用眼科剪剪成约1mm组织块，用0．25%的胰蛋白酶室温消化3～5min后吹打收集细胞接种在含10%胎牛血清的DMEM培养液的培养瓶中，放入37℃、5%CO2培养箱培养。当大部分细胞贴壁后更换新鲜培养液，以后隔天换液，逐天观察，当细胞长成单层时，即可进行传代。将传至3～4代的鼠胚成纤维细胞加入含10μg/ml丝裂霉素－C的DMEM培养基中培养2～3h后，常规胰酶消化，单细胞悬液按密度5×104/ml制成50μl的液滴，当成纤维细胞贴壁伸展后，更换IVC－ONE液，用于共培养。

1．3 胚胎体外培养分组

将获得的已发育到2细胞期的鼠胚胎分别置于上述3组及对照组液滴中培养，36h后更换IVCTWO培养液。

1．4 胚胎体外发育观察

每日上午8时观察胚胎发育情况，连续观察3d;记录培养24h时发育到4～8细胞胚胎数，48h发育到桑葚胚数，72h发育到囊胚数。早囊胚为出现囊胚腔，胚胎直径未变，透明带无明显变化;扩张期囊腔为囊腔扩张，直径大于最初的胚胎直径，透明带变薄。

1．5 囊胚总细胞数及细胞凋亡数计数

培养72h的囊胚胚胎用Hoechst染色试剂盒染色，计数囊胚总细胞数目及囊胚细胞凋亡数。细胞发生凋亡时染色质固缩，Hoechst染色时细胞核呈致密浓染或碎块状致密浓染。

2 结果

2．1 扩张囊胚形成率和总囊胚形成率

培养24～48h时到达4～8细胞及桑葚胚的比例4组间无统计学差异(P＞0．05);培养72h时扩张囊胚形成率和总的囊胚形成比例人卵丘细胞共培养组分别为54．17%、61．67%，鼠卵丘细胞共培养体组分别为53．85%、68．13%，鼠成纤维细胞共培养组分别为 51．40%、65．42%，对照组分别为34.38、45.31%，共培养3组间无统计学差异(P＞0.05)，但均明显高于对照组(P＜0.05)。见表1。

2．2 囊胚总细胞数及囊胚细胞凋亡率

人卵丘细胞共培养组囊胚总细胞数平均71．26个，细胞凋亡率7．68%;鼠卵丘细胞共培养组囊胚总细胞数平均76．52个，细胞凋亡率7．44%;鼠成纤维细胞共培养组囊胚总细胞数平均64．41个，细胞凋亡率8．46%;对照组囊胚总细胞数平均38．57个，细胞凋亡率16．28%。共培养3组间囊胚总细胞数及囊胚细胞凋亡率无统计学差异(P＞0．05)，但与对照组比较存在统计学差异(P＜0．05)。见表2。

表1 各组共培养体系体外胚胎培养发育情况

表2 各组共培养体系体外细胞培养囊胚细胞数目及细胞凋亡数目情况

3 讨论

3．1 共培养体系对早期胚胎发育的影响

胚胎与体细胞共培养的目的是为了最大限度地满足胚胎在不同细胞期对物质的全面需求，为早期胚胎营造一种理想的生存环境。本研究中将每只小鼠的胚胎随机分成4组，通过自身对照排除了小鼠个体差异带来的影响，并观察不同共培养体系对小鼠早期胚胎发育的影响。结果显示，共培养组与对照组发育到4～8细胞期及桑葚期的胚胎率均无差异，但发育的囊胚率共培养组均明显高于对照组，尤其是扩张囊胚率显著提高，而各共培养组间囊胚率无差异。说明不同种属、不同组织来源的共培养细胞均有改善体外培养环境的能力。这一结果与O-mar Farouk［1］和 Wang［2］等研究一致。

3．2 共培养体系对囊胚细胞数及囊胚细胞凋亡率的改善

囊胚质量由囊胚细胞数及囊胚细胞凋亡率来衡量，囊胚细胞数是反映囊胚发育潜力最敏感的指标之一，囊胚细胞凋亡率与移植后胚胎发育潜力成负相关。本研究观察的3组共培养体系之间囊胚细胞数及囊胚细胞凋亡率无统计学差异，而与对照组比较存在差异，说明共培养体系提高了胚胎细胞分裂速度，降低了细胞凋亡率;将体细胞作为营养细胞与胚胎共培养，在一定程度上能够克服胚胎体外发育阻滞，促进早期胚胎发育，提高胚胎质量，增加囊胚形成率，这一结果与相关研究［3～7］报道一致。

3．3 共培养体系的生理协同作用

在生理活动中，单个细胞虽然能生长繁殖，但不如群体细胞生存力强，多细胞量更易于培养，说明细胞间能相互沟通信息，相互支撑生长增殖。有研究认为胚胎密度及胚胎间的距离决定胚胎发育能力，胚胎在发育过程中能分泌胰岛素样生长因子－Ⅰ和Ⅱ，血小板激活因子，血小板源生长因子等促进胚胎体外发育的因子，因此最佳的培养密度取决于胚胎发育过程中胚胎因子的分泌数量［8～11］。Ando 等［12］对输卵管上皮细胞转化形成的永生细胞共培养系统分泌细胞因子情况进行检测发现，存在有高浓度的白介素、白血病抑制因子(LIF)、转化生长因子和碱性成纤维细胞生长因子;Spandorfer等［13］在子宫内膜共培养的条件培养基中检测到高浓度的LIF;Parikh等［14］在人颗粒细胞共培养的培养基中检测到高浓度的白介素－6、胰岛素样生长因子－I及血管内皮生长因子;鼠成纤维细胞也可以分泌多种细胞因子促进共培养细胞的增殖［15，16］。这些发现说明不同类型的体细胞既会分泌一种与细胞类型无关的相同成分，同时又会分泌与细胞类型相关的特异性因子，使胚胎在共培养系统中处于生长因子和细胞因子浓度升高的动力学环境中，促进胚胎发育。

本研究显示，不同类型的体细胞共培养体系均可在体外为胚胎发育提供一种类似于体内环境、有利于胚胎体外发育的生长条件。动物自体颗粒细胞共培养，既可提高胚胎体外培养效率，又能避免种属间交叉污染，而且颗粒细胞伴随取卵获得，取材方便。不足之处是颗粒细胞质量无法选择，不便于质量控制。鼠成纤维细胞可以成批大量培养，冷冻保存，便于长期使用和质量控制，如果能消除种属间交叉污染的风险，鼠成纤维细胞共培养体系将是一个很好的选择。共培养促进胚胎体外发育的机制仍然需要进一步探讨，为胚胎工程的发展提供新思路。

1 Omar Farouk FN，Vlad M．In vitro development of mouse pronuclear embryos to blastocysts in sequential media with and without co－culture of autologous cumulus cells［J］．J Reprod Dev，2008，54(5):385－390．

2 Wang B，Zhao Y，Liu J，et al．Co－culture of mouse blastocysts and their epigenetic modification［J］．Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao，2009 ，25(5):733－738．

3 van Soom A，Ysebaert MT，de Kruif A．Relationship between timing of development，morula morphology，and cell allocation to inner cell mass and trophectoderm in in vitro － produced bovine embryos［J］．Mol Reprod Dev，1997，47:47 －56．

4 Pakrasi PL，Jain AK．Cyclooxygenase－2－derived endogenous prostacyclin reduces apoptosis and enhances embryo viability in mous e［J］．Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids，2008，79:27 －33．

5 Jeong WJ，Cho SJ，Lee HS，et al．Effect of cytoplasmic lipid content on in vitro developmental efficiency of bovine IVPembryos［J］．Theriogenology，2009，72:584 － 589．doi:10．1016/j．theriogenology．2009．04．015．

6 Deb GK，Dey SR，Bang JI，et al．9－cis retinoic acid improves developmental competence and embryo quality during in vitro maturation of bovine oocytes through the inhibition of oocyte TNF－{alpha}gene expression［J］．J Anim Sci，2011，89:2759 － 2767．

7 Gautam KD，Jong IJ，Tae HK，et al．Improved blastocyst development of single cow OPU－derived presumptive zygotes by group culture with agarose － embedded helper embryos．［J］Reprod Biol Endocrino l，2011，9:121．

8 Garcia A，Salaheddine M．Effects of repeated ultrasound－guided transvaginal follicular aspiration on bovine oocyte recovery and subsequent follicular development［J］．Theriogenology，1998，50:575 －585．

9 Fukui Y，Kikuchi Y，Kondo H，et al．Fertilizability and developmental capacity of individually cultured bovine oocytes［J］．Theriogenology，2000，53:1553 －1565．

10 Doherty EM，Wade MG，Hill JL，et al．Effects of culturing bovine oocytes either singly or in groups on development to blastocysts［J］．Theriogenology，1997，48:161 －169．

11 Opichandran N，Leese HJ．The effect of paracrine/autocrine interactions on the in vitro culture of bovine preimplantation embryos［J］．Reproduction，2006，131:269 －277．

12 Ando H，Kobayashi M，Toda S，et al．Establishment of a ciliated epithelial cell line from human Fallopian tube［J］．Hum Reprod，2000，15(7):1597 －1603．

13 Spandorfer SD，Navarro J，Levy D，et al．Autologous endometrial coculture in patients with in vitro－fertilization(IVF)failure:correlations of outcome with leukemia inhibiting factor(LIF)production［J］．Am J Reprod Immunol，2001，46(6):375 －380．

14 Parikh FR，Nadkarni SG，Naik NJ，et al．Cumulus coculture and cumulus－aided embryo transfer increases pregnancy rates in patients undergoing in vitro fertilization［J］．Fertil Steril，2006，86(4):839－847．

15 Chin AC，Fong WJ，Goh LT，et al．Identification of proteins from feeder conditioned medium that support human embryonic stem cells［J］．JBiotechnol，2007，130(3):320 －328．

16 Eiselleova L，Peterkova I，Neradil J，et al．Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells［J］．Int JDev Biol，2008，52(4):353 －363．