乳腺癌多层螺旋CT灌注成像与微血管生成的相关性研究

李丽艳 LI Liyan

周顺科1 ZHOU Shunke

刘 军1 LIU Jun

谭泽兵2 TAN Zebing

李代强3 LI Daiqiang

孙 划4 SUN Hua

2. 解放军国防科技大学医院放射科 湖南长沙 410073

3. 中南大学湘雅第二医院病理科 湖南长沙 410011

4.吉林市第二中心医院放射科 吉林吉林 132001

随着多层螺旋CT（multi-slice spiral computed tomography, MSCT）的广泛应用，CT灌注成像（perfusion imaging, PI）技术已经逐步应用于脑血管病变和脑肿瘤的评价[1]，国内外应用于乳腺肿瘤方面的研究仍处于起步阶段[2,3]。本研究对38例（53个）乳腺癌块及良性实质肿块进行MSCT灌注检查，以探讨乳腺癌的血流灌注特点与微血管生成的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2007-07～12于湘雅二医院行B超或体检发现的38例（53个肿瘤）女性乳腺实质性肿瘤患者的病例资料，年龄12～63岁。所有病例均有完整的临床及手术病理资料。38例中乳腺癌27例（28个肿瘤），良性实质肿瘤11例（25个肿瘤）。乳腺癌中，导管内癌4例，浸润性导管癌19例（20个），浸润性小叶癌1例，混合型3例；良性实质肿瘤中，导管内乳头状瘤2例（7个），纤维瘤5例（6个），纤维腺瘤4例（12个）。病灶最大径0.8～10.8cm。本研究经湘雅二医院伦理委员会批准，所有受检患者均签署CT检查知情同意书，于月经结束后3～5d进行MSCT扫描。排除造影剂过敏及心、肝、肾等重大脏器功能衰竭者。

1.2 MSCT灌注扫描仪器与方法

1.2.1 扫描设备 Siemens Sensation 64层螺旋CT扫描仪。

1.2.2 扫描前准备 经肘正中静脉穿刺18G静脉留置针，训练患者呼吸，确保扫描过程中患者静止不动，使各扫描序列中病灶保持同一位置。

1.2.3 检查方法 ①常规MSCT平扫：检查者俯卧于检查床上的木制支架上（自制），双臂上举，使乳房自然下垂。于吸气末扫描，平扫范围自腋窝顶至乳腺下缘水平。扫描参数为管电压120kV，管电流100mA，探测器宽64mm×0.6mm，采用容积采集，重建层厚及间距为7.0mm。确定病变部位，选择肿瘤最大层面为灌注扫描层面。②灌注扫描成像：自动高压注射器以7ml/s注射速率经前臂静脉注入20ml生理盐水确定无渗漏后，以6ml/s注射速率注入300mgI/ml非离子造影剂50ml，再以同样速率注入20ml生理盐水，延迟5s；选用多层连续动态电影扫描模式行灌注扫描，扫描条件同平扫，探测器宽度24mm×1.2mm，重建层厚为7.2mm。扫描分3个序列，每个序列时间为30s，间隔10s让患者呼吸换气。每个扫描序列的每次球管曝光时间为0.5s，间隔分别为0.5、2.5、4.5s，总共得到4×46幅图像。有效放射剂量＝596.7×0.05＝29.84msv。

1.2.4 图像后处理 将扫描数据传送至西门子专用图像处理工作站Leonardo，采用Functional CT中Body Perfusion软件处理数据，版本号为Leonardo 2006A。采用最大层面全肿瘤法[4]分别选取乳腺实质性肿瘤组织、癌旁正常乳腺腺体组织为兴趣区，软件自动处理得出各兴趣区的时间-密度曲线（time-density curve,TDC）及最大密度投影（maximum intensity projection,MIP）、增强平均值（average value, AV）、血流量（blood flow, BF）、血容量（blood volume, BV）、灌注起始时间（time to start, TTS）、灌注峰值时间（time to peak, TTP）和血管表面通透性（permeability surface, PS）、Patlak血容量（Patlak blood volume, PBV）等灌注参数。

1.3 免疫组化仪器、试剂及检查方法

1.3.1 主要仪器、试剂 Nikon ECLIPSE 55i双目光学显微镜（日本）；LEICA RM2235石蜡切片机（德国）；鼠抗人CD105单克隆抗体（编号：ZM-0297）购自北京中杉金桥生物公司；鼠抗人VEGF单克隆抗体（编号：MAB-0243）、液体AEC酶底物显色试剂盒（编号：AEC-0037）、即用型免疫组织化学超敏UltraSensitiveTMS-P试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。

1.3.2 标本取材 38例乳腺实质肿瘤均于MSCT检查后2d内手术，取术前已行灌注检查者共53个肿瘤作对照，选取肿瘤实质部分及标本中距癌块1cm无癌浸润的腺体组织。所有标本均经10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋连续切片，厚3μm，常规HE染色，用于免疫组化的切片贴于经多聚赖氨酸处理的载玻片上。

1.3.3 免疫组化染色 石蜡切片脱蜡至水，PBS冲洗后用过氧化物酶阻断溶液阻断内源性过氧化物酶活性，EDTA抗原热修复法-水浴法修复抗原，PBS冲洗后羊非免疫血清室温孵育10min阻断非特异染色，分别加一抗（鼠抗人CD105单克隆抗体、鼠抗人VEGF单克隆抗体）4℃过夜，PBS冲洗后加生物素标记的二抗，PBS冲洗后加链霉菌抗生素-过氧化物酶溶液室温孵育10min后，PBS冲洗后AEC染色，苏木素复染，水性封片剂封片。以已知乳腺癌阳性片作为阳性对照，PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.3.4 结果判断 CD105标记的微血管密度（microvessel density, MVD）按照Zhou等[5]的计数方法，先用100倍光镜扫视整个切片，选择3个微血管密度最高区（热点），然后在400倍光镜下计数热点中棕红色的微血管数目。凡单个孤立的或多个紧密排列的内皮细胞团，只要与临近肿瘤细胞或周围结缔组织分界清楚，无论有无管腔，即可计数为1个微血管数；管径＞8个红细胞或伴有明显平滑肌的脉管不计数。取3个视野的微血管数平均值作为该标本的MVD值。

胞质呈红色或棕红色颗粒状的为血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）阳性细胞，按Mattern等[6]的等级评分方法，根据综合染色强度和染色细胞的百分数评估VEGF的表达。①按染色强弱分：0分，阴性；1分，弱，淡红色；2分，中等，红色；3分，强，棕红色。②按着色细胞占视野的百分数分：0分，无阳性细胞；1分，阳性细胞≤25%；2分，阳性细胞26%～50%；3分，阳性细胞＞50%。将①②数值相加判定结果，0～2分为（－），3～4分为（+），5～6分为（++）。

1.4 统计学方法 采用SPSS 11.5软件，数据以均数±标准差（）表示，多个样本均数的比较采用方差分析（ANOVA）及两两比较的SNK检验，独立样本均数比较采用t检验；采用Pearson相关和Spearman等级相关进行相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 讨论

2.1 乳腺癌、良性实质肿瘤、癌旁正常腺体组织标本病理及免疫组化结果 在100倍视野下找出微血管密集区后，400倍视野下计数，乳腺癌组织的MVD为（24.83±6.73）个/视野，VEGF为（+）或（++）；乳腺良性实质肿瘤组织的MVD为（2.16±2.32）个/视野，VEGF 为（－）或（+）；乳腺癌旁正常乳腺组织的MVD为（0.89±1.61）个/视野，VEGF均为（－），见图1。

图1 乳腺浸润性导管癌。A.肿瘤细胞核大、异型、深染，排列紊乱，纤维间隔较少（HE，×100）；B.MVD微血管结构被染成棕红色，微血管“热点”区域多位于癌块边缘带（×100）；C.VEGF阳性细胞质呈棕红色（×100）

2.2 乳腺肿瘤组织MVD与VEGF相关性分析 VEGF（－）、（+）、（++）各级别乳腺肿瘤组织间MVD差异有统计学意义（P＜0.05），乳腺肿瘤组织的MVD计数与VEGF级别呈正相关（r＝0.82，P＜0.05）（图2）。

2.3 MSCT灌注4种类型TDC曲线的乳腺肿瘤组织MVD比较 TDC按其形态分为流入型、平台型、流出型、平坦型4型（图3）。

图2 乳腺肿瘤组织MVD与VEGF的相关性

本组4型TDC曲线的乳腺实质肿瘤MVD差异有统计学意义（F＝6.47，P＜0.01），多重比较除流出型与平台型、流入型与平坦型之间差异无统计学意义（F＝0.73、0.72，P＞0.05）外，其余组间差异均有统计学意义（P＜0.05），且流出型和平台型乳腺肿瘤的MVD高于流入型和平坦型（P＜0.05）（表1）。

2.4 乳腺癌组织与癌旁正常乳腺组织、良性实质肿瘤MVD比较 乳腺癌组织MVD高于癌旁正常腺体组织、良性实质肿瘤组织，差异有统计学意义（P＜0.01）（表 2）。

2.5 乳腺癌组织MSCT灌注参数与MVD的相关性乳腺癌组织MIP、AV、BF、BV、PS、PBV与MVD呈正相关（r＝ 0.44、0.46、0.50、0.49、0.52、0.47，P＜0.05）；TTS、TTP与MVD无相关性（r＝0.31、－0.23，P＞0.05）。见表3、图4。

3 讨论

表1 4型TDC乳腺实质肿瘤的MVD比较（）

表1 4型TDC乳腺实质肿瘤的MVD比较（）

注：（1）与（3）、（4）及（2）与（3）、（4）分别比较，P ＜0.05

表2 乳腺癌与癌旁正常腺体、良性实质肿瘤MVD比较（）

表2 乳腺癌与癌旁正常腺体、良性实质肿瘤MVD比较（）

注：（1）乳腺癌与癌旁正常腺体比较；（2）乳腺癌与良性实质肿瘤比较

表3 乳腺癌MSCT灌注参数与MVD相关性分析（）

表3 乳腺癌MSCT灌注参数与MVD相关性分析（）

图4 乳腺浸润性导管癌MSCT灌注参数。A.MIP图；B.AV图；C.BF图；D.BV图；E.TTS图；F.TTP图；G.PS图；H.PBV图，显示右乳肿块边缘带呈黄绿色至红色的高灌注区

3.1 MVD、VEGF在乳腺癌中的表达及意义 乳腺癌是血管生成依赖性疾病，肿瘤新生血管情况是评价肿瘤生长、转移、良恶性及恶性程度的重要指标[7,8]。血管生成是一个复杂的过程，受到肿瘤细胞、血液、宿主基质等产生的多种血管生成和抗血管生成因子的调节，VEGF是众所周知的、强大的血管生成因子，能促进肿瘤微血管及内皮细胞有丝分裂，并可水解基底膜，引起血管通透性增高。VEGF和MVD是乳腺癌患者生存期的预测因素。CD105和CD34、CD31等均可用来标记MVD，但Dales等[9]、唐明朝等[10]认为，CD105主要在处于增殖状态的肿瘤组织血管内皮细胞中强表达，是目前衡量内皮细胞增殖状态较准确的指标，优于其他如CD31、CD34等泛血管内皮细胞标志物，用CD105测定的MVD值是乳腺癌的一个独立的预后指标，能定量区别肿瘤新生血管和已存在血管。本组乳腺癌组织VEGF为（+）或（++），良性实质肿瘤VEGF为（－）或（+），癌旁正常腺体组织VEGF为（－）；采用CD105标记MVD，结果显示，乳腺癌组织的MVD计数明显高于乳腺良性实质肿瘤及癌旁正常组织，乳腺肿瘤VEGF评分高者MVD计数高于VEGF评分低者，其MVD计数与VEGF评分呈正相关（r＝0.82，P＜0.05），提示乳腺肿瘤组织通过分泌VEGF，促进肿瘤微血管生成，乳腺癌组织VEGF高于其他组织，血管生成也相应高于其他组织。

肿瘤脉管靶向基因治疗具有特异性强、毒副作用小、作用持久等优点，已成为肿瘤生物学治疗的理想靶点[7,11]，从而为乳腺癌综合治疗提供一条崭新的途径。通过穿刺活检可以探测MVD，但穿刺活检属于创伤性检查，且穿刺点的情况不能反映整个肿瘤的MVD情况。因此，实施一种安全、无创、全面检测MVD的可靠方法已成为当务之急。

3.2 乳腺癌MSCT灌注与MVD的关系 乳腺癌传统的影像学诊断及普查主要依靠乳腺摄影和超声，主要是观察乳腺癌的大体形态学改变，但对于乳腺癌与良性实质肿瘤鉴别诊断及肿瘤血供的观察有局限性。活体获得病变组织的生物学特征及功能方面的信息一直是临床医学工作者所追求的目标。MSCT灌注成像是近年开发的一种无创性评价组织器官血流灌注的新方法，反映了生理功能的改变。Miles等[12]认为用于CT增强的非离子型对比剂与核医学的放射性示踪剂有相似的药物代谢动力学，其代谢状况符合放射性核素示踪剂稀释原理。通过在体静脉团注对比剂后对选定层面行动态扫描，获得该层面内每一像素的TDC曲线，根据该曲线利用数学模型计算出BF、BV、TTS、TTP、PS等参数来评价组织器官的灌注状态。本研究采用标准灌注分析法和Patlak灌注分析法2种数学模型计算各灌注参数。在肿瘤CT灌注的后处理中，以最大层面全肿瘤区域法为优，可得到比最高灌注区法可重复性高的数据，故本研究采用最大层面全肿瘤区域法分别选取乳腺实质性肿瘤组织、癌旁正常乳腺腺体组织为兴趣区[4]。

3.2.1 TDC类型与MVD/VEGF的关系 灌注组织TDC的横坐标为时间（s），纵坐标为注射造影剂后组织兴趣区的CT值（Hu），反映造影剂在该组织中对比剂浓度的变化-碘聚集量的变化，反映了组织灌注量的变化。本研究将TDC按形态分为流入型、平台型、流出型、平坦型，4型TDC曲线的乳腺肿瘤的MVD差异有统计学意义（P＜0.01），且流出型和平台型的MVD高于流入型和平坦型（P＜0.05），与本组前期研究所示TDC为流出型和平台型的乳腺实质肿瘤分别有76.47%、71.43%为乳腺癌[13]相一致。据此推测，流出型与平台型TDC曲线表现在动脉期迅速强化达峰值（15～25s内CT值升高＞25Hu），可能与肿瘤新生血管增多、血流量增高有关；其后迅速下降或处于平台，可能与其在较多VEGF作用下，新生血管基底膜形成不完全、渗透性增强导致的造影剂渗出血管有关。

3.2.2 灌注参数与MVD的关系 MSCT灌注成像可反映瘤体的血流动力学变化，并可对各灌注参数进行定量分析。本组乳腺癌MVD高于正常乳腺组织及良性实质肿瘤，与本组前期研究所示乳腺癌组织BF、BV、PS增高，呈高灌注、高渗透表现[13]一致，提示乳腺癌组织通过分泌VEGF促进肿瘤血管生成，使BF、BV增高。而这些微血管的血管壁基底膜是不完整的，细胞间隙较大，导致对比剂外渗，表现为PS增高，使乳腺癌灌注不同于正常腺体组织和良性实质肿瘤的灌注。邹艳等[14]、武洪林等[15]通过研究脑肿瘤MR灌注成像，发现强化区域不能代表肿瘤的恶性程度，高级和低级脑胶质瘤相对脑血容量（relative cerebral blood volume, rCBV）差异有统计学意义（t＝5.493，P＜0.01），rCBV与肿瘤的MVD呈正相关（r＝0.447，P＜0.05），可以评估肿瘤的级别。据此提出肿瘤恶性程度最高的组织均应取材于灌注明显增加区域，而不是取材于强化最明显的区域。本组乳腺癌组织MVD高于癌旁正常腺体组织、良性实质肿瘤组织，乳腺癌组织MSCT灌注参数MIP、AV、BF、BV、PS、PBV与MVD呈正相关（r＝0.44、0.46、0.50、0.49、0.52、0.47，P ＜ 0.05），提示MSCT灌注成像可以在一定程度上反映乳腺癌的微血管分布和血流灌注改变，由此推断乳腺实质性肿块MVD较高的区域，这一点在定位活检时也更有意义。MR定位引导穿刺活检对穿刺器械有较高的要求，而CT定位活检则不受此限制，更具备指导立体定位穿刺时确定靶点的优势，可以及早地发现、诊断癌变，预测肿瘤脉管靶向基因治疗疗效。

综上所述，MSCT灌注成像不仅能显示解剖细节，而且能获得肿瘤的血供参数，在乳腺癌的诊断、鉴别诊断、活检定位、预测肿瘤脉管靶向基因治疗疗效等方面提供了有价值的信息，可作为活体无创检测乳腺癌微血管生成情况的一种影像学研究手段。与其他观察组织器官血液动力学的方法相比，MSCT灌注成像具有经济、实用，无需使用放射性同位素，图像的空间、时间分辨率高，扫描设备简单，影响因素少等优点，有望在活体获得乳腺肿瘤组织的生物学特征及功能方面发挥更大的作用。但肿瘤血管生成是一个极其复杂的病理过程，毛细血管内皮细胞增生可能生成、也可能没有生成功能性的管腔化血管，而灌注成像只对功能性可灌注的毛细血管敏感，只能近似地反映肿瘤的血管生成。因此，对灌注成像结果的解释不宜过于武断，仍需结合常规影像学检查的形态学特征进行综合分析。

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