陡脉冲不可逆电击穿技术在肿瘤方面的研究进展

宋作庆 徐萧洪 周清华

1.天津医科大学总医院肺部肿瘤外科，天津市肺癌研究所，天津肺癌转移与肿瘤微环境重点实验室；2.天津医科大学护理学院内外科教研室

据WHO资料报告，癌症是发病率和死亡率增长最快，对人类健康和生命威胁最大的疾病，外科手术目前仍然是治疗癌症的首选方法。传统的外科手术虽有立竿见影的效果，但无法解决复发和转移问题；放射疗法虽然疗效确切，但特异性较差限制了其广泛应用；化学疗法虽然可对实体瘤和血液系统肿瘤起效，但不良反应较大，容易产生耐药性；现有的物理治疗方法，包括热疗法、磁疗法、高强度聚焦超声疗法，由于设计原理和使用方法的局限性，都存在不同程度的缺陷；新近出现的免疫疗法和基因疗法虽然不良反应较小，但其疗效和确切机制仍有待进一步临床验证。为此人们一直在寻求更为有效的肿瘤治疗策略。

G.A.Hofmann 等[1]根据细胞的可逆性电击穿特性提出了癌症的电穿孔疗法(EPT)，随着电脉冲剂量的增加，细胞出现不可恢复的破裂导致细胞死亡，这种现象称作不可逆性电击穿(IREB)[2]，目前有研究采用了一种上升时间为ns级的指数衰减脉冲——陡脉冲作用于肿瘤细胞，它可使肿瘤细胞膜发生不可逆性电击穿导致细胞死亡，对于深入开展陡脉冲对肿瘤细胞的作用机理与靶向性治疗及临床应用研究具有重要的科学意义，已引起国内外同行的高度关注。

1 脉冲治疗肿瘤的基本机制

Karl H.Schoenbach等[3]发现不用化疗药物，单独使用电场度为26～300kV/cm、脉冲宽度为10～300ns的脉冲电场可以导致肿瘤细胞程序性死亡(凋亡)并能有效抑制肿瘤的生长。将适当的电脉冲引入到癌症组织中，使恶性肿瘤细胞发生不可逆性电击穿，破坏肿瘤的生存条件，达到杀伤肿瘤细胞的目的。

陡脉冲不可逆性电击疗法基于电穿孔理论，是通过在降低电压峰值和脉宽、提高频率，上升时间为纳秒级的持续指数衰减脉冲引入肿瘤组织中，诱导肿瘤细胞发生电穿孔、电处理以及不可逆性电击穿等生物电效应，杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞增殖，从而达到治疗肿瘤的目的[4]，其主要机制如下。

1.1 陡脉冲作用下细胞的电场分布细胞的跨膜电位是维持细胞生理功能的极为重要的参数。陡脉冲的电场基本特性是对处于场中的物质有力的作用。细胞膜和核膜内外表面有很强的电场分布，同时由于细胞膜的介电常数与细胞外液、细胞质的不同，核膜的介电常数与细胞质、核仁的不同，从电磁基本理论出发，必然有作用于细胞膜和核膜表面的电场力。

1.2 电场应力的不可逆性电击穿机理对于生物膜结构，液态镶嵌模型是普遍接受的模型。在陡脉冲的电场应力作用下，细胞膜和核膜会出现电穿孔现象，膜微孔量增大，大量的离子通过膜的离子通道，打破了细胞内外的离子平衡，引起各种细胞破裂等生物物理现象的发生，对细胞膜和核膜的膜结构造成不可恢复性的破坏。

1.3 不可逆性电击穿直接作用陡脉冲作用于肿瘤细胞时，细胞膜、核膜等处于不断地充放电动态过程，从而在膜中及其周围形成电场。因膜的介电常数与周围原生质的介电常数不等，必然存在作用于膜上的电场力，使细胞膜厚度不断变薄，最后导致其发生穿孔；平时不能通过细胞膜的离子、分子等此时大量涌入，对细胞膜、细胞核、核仁、线粒体等造成很高的肿胀压力，使其发生不可逆性电击穿并导致死亡。

1.4 改变生存环境研究发现陡脉冲可以导致电极针阳极区肿瘤组织呈脱水状态，阴极去肿瘤组织呈水肿反应。肿瘤细胞及周围组织的pH值改变，使细胞内的钙离子浓度降低，肿瘤细胞酶的活性破坏，组织蛋白坏死变性、凝固沉淀，最终导致肿瘤组织的死亡。

米彦[5]等实验中，细胞内钙离子浓度检测实验发现，陡脉冲电场刺激能够使肝癌细胞内钙离子浓度发生变化，变化的程度与陡脉冲电场的参数有关。采用激光扫描共聚焦显微镜观察到肝癌细胞内钙离子浓度发生变化，使得细胞内钙离子浓度稳态失调或大幅度振荡，从而有可能诱导细胞凋亡；流式细胞术Annexin V 凋亡检测结果证实了陡脉冲电场能诱导肝癌细胞凋亡，并且较低的电压峰值、较宽的脉冲宽度比较高的电压峰值、较窄的脉冲宽度能更有效地诱导肝癌细胞凋亡。

1.5 脉管效应陡脉冲作用组织后，可导致血管内皮细胞及肌层呈凝固性坏死，影响组织血供，导致细胞死亡；可非选择性杀伤靶区肿瘤组织边缘的毛细淋巴管，有效减少治疗后局部残留的瘤细胞通过肿瘤边缘的毛细淋巴管转移到其他部位的可能性。

1.6 凋亡作用研究发现陡脉冲治疗组的细胞凋亡率明显高于对照组，且凋亡细胞伴有Bcl-2与Bax蛋白表达比值的降低。由此可推测陡脉冲诱导细胞凋亡且可能是通过Bcl-2与Bax蛋白的调节来实现的。

1.7 降低血流灌注，激活机体免疫系统国外学者发现[6]发现陡脉冲作用可减少肿瘤血流灌注60%～70%，导致肿瘤生长延迟0.2d。但是这种血流的改变只是暂时的，持续1h左右开始恢复，并在24h内达正常水平。有学者[7]在陡脉冲治疗兔肝VX2鳞癌的实验中发现，EP作用后局限于脉冲电场区域的肿瘤组织颜色发生改变。随后瘤体内注射荧光素，在钨灯照明下观察到脉冲作用区组织无染料着色，表明血流灌注被切断，大约15～20min后开始逐渐恢复。并且在电极针插入处无出血现象。实验中也观察到陡脉冲电场致肿瘤组织颜色变化，组织切面有瘀血区。据此推测陡脉冲电场作用可能导致肿瘤组织血流灌注降低，造成组织缺氧而抑制肿瘤细胞的生长。另外，还观察到肿瘤组织周围有单核细胞及淋巴细胞的浸润。提示陡脉冲电场可能激活了机体免疫系统，从而进一步抑制肿瘤的生长。

2 脉冲治疗的研究及疗效

2.1 体外细胞实验熊兰[8]等应用不同剂量的脉冲，分别处理良性肿瘤和恶性肿瘤。从实验现象和结果来看，脉冲使肿瘤组织发生电化学反应和组织结构的改变，破坏了肿瘤组织的生存环境。肿瘤组织发生多种病理反应，细胞核固缩、细胞膜崩溃、线粒体消失、核蛋白凝固坏死，导致肿瘤组织的死亡。

研究发现陡脉冲作用人卵巢腺癌细胞株SKOV3后细胞发生明显肿胀，细胞核固缩扫描电镜显示细胞膜出现孔洞并发生破裂，细胞质外喷透射电镜发现核肿胀，核膜不完整，胞质内细胞器结构模糊，微绒毛肿胀，胞浆、线粒体肿胀、空泡化，细胞膜多处断裂。表明陡脉冲使恶性肿瘤细胞发生不可逆性电击穿并导致其死亡。

2.2 动物实验陡脉冲在动物实验研究中已经涉及到各类实体肿瘤，包括肝肿瘤、纤维肉瘤、骨肉瘤、黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、舌癌、皮肤癌等，并对动物的肝癌模型、胰腺癌模型、前列腺癌模型和皮肤肿瘤模型[9,10]等施行了体内IRE手术，均取得了良好的治疗效果，为临床试验提供了详实的理论和丰富的实践经验。

Salomskaite_Davalgiene S等[11]分析了电脉冲对鼠肺癌组织的影响，发现当给予1300V/cm，持续0.1ms的电脉冲刺激时，通过光电镜观察到治疗后肿瘤组织坏死明显增加，肿瘤细胞间隙变大，量细胞结构被破坏，可见细胞膜及核膜破裂。姚陈果等[12]研究了电脉冲对人卵巢腺癌、胃癌、直肠癌等活体肿瘤组织的作用，发现阳极区因脱水而呈现凝固性坏死。

姚陈果[13]等在对鼠癌细胞的研究，从实验结果和光镜观察，可以看到陡脉冲电场作用在靠近两针电极处，尤其是在阳极区对肿瘤细胞的杀伤作用明显，呈凝固性坏死征象，这可能与恶性肿瘤细胞具负电性有关；而进一步从超微结构变化分析揭示陡脉冲电场作用同样可先引起细胞质膜的通透性增加，使得细胞内外液离子平衡被打破，并随作用时间的延长，最终导致细胞生物膜系统不可逆性电穿，整个细胞结构被破坏而死亡。因此，可以推测陡脉冲电场作用可通过不可逆性电击穿直接杀伤肿瘤细胞，呈现急性损伤效应。

3 展望

陡脉冲的电穿孔治疗癌肿是有效的，与其他局部疗法相比具有较多的优越性。陡脉冲在肿瘤治疗上的应用前景取决于：首先要能对肿瘤组织产生有效的损伤，其次是所致坏死组织的转归如何，再者就是对靶组织邻近的组织器官是否安全。从目前的实验中可见陡脉冲在有效杀伤肿瘤组织的同时，对主要脏器及对靶区周围组织都是安全的，在坏死的肿瘤组织与瘤周正常组织间有清晰的界限。未见明显的胆漏、出血、针道转移等不良反应。研究表明单纯采用陡脉冲来治疗肿瘤是可行的，电脉冲疗法在前期的研究中取得了显著的成绩。但是电脉冲治疗仪器的研制、治疗机制的完善、临床试验的开展、最佳参数的选择，残存肿瘤细胞的处理及安全性等都有待进一步的研究，尚需通过大量的动物和临床实验来寻求最佳的治疗剂量和解决残留癌细胞等一系列问题。只有不断地在实践中积累经验，使之日趋成熟。陡脉冲技术有望成为肿瘤综合治疗中前景广阔的新替代疗法。总之，肿瘤的电穿孔治疗是一项多学科交叉的、综合性的研究课题，这项技术还需在实践中不断探索、完善以造福于人类。

[1] Van schil PE,De waele M,Hendriks JM,et al.Is there a role for surgery in stage ⅢA-N2 non-small cell lung cancer?[J]. Chin J Lung Cancer,2008,11(5): 615-621.

[2] Tibaldi C,Mazzoni E,Arcabasso G,et al.Cisplatin plus gemcitabine as adjuvant chemotherapy for radically resected non-small-cell lung cancer: a pilot study[J].Clin Lung Cancer,2009,10(1): 53-57.

[3] BEEBE S J,FOX P M,REC L J,et al.Nanosecond Pulsed Electric Field (nsPEF) Effects on Cells and Tissues:Apoptosis Induction and Tumor Growth Inhibition [J].IEEE Trans on Plasma Science,2002,30(1):286-292.

[4] Yao CG,Sun CX,Mi Y.Experimental studies on killing and inhibiting effects of steep pulsed electric field (SPEF) to target cancer cells and solid tumor[J].IEEE Trans Plasma Sci,2004,32(4):1626-1633.

[5] 米彦等.陡脉冲电场对体外人肝癌细胞内钙离子浓度的影响[J].中国生物医学工程学报.2008,27(4),551-556

[6] Al-Sakere B,Bernat C,André F.et al.A study of the immunological response to tumor ablation with irreversible electroporation[J].Technology in Cancer Research and Treatment,2007,6(4):301-305.

[7] Garcia PA,Rossmeisl JH,Robertson J,et al.Pilot study of irreversible electroporation for intracranial surgery[J].Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc,2009,1:6513-6516.

[8] 熊兰,孙才新,李大强,等.能量可控陡脉冲杀伤肿瘤的离体试验研究[J].生物医学工程学杂志,2002,19(3):440-443.

[9] Liron Miller,Jonathan Leor,and Boris Rubinsky.Cancer cells ablation with irreversible electroporation[J].Technology in Cancer Research and Treatment,2005,4(6):1-7.

[10] Richard Nuccitelli,Xinhua Chen,Andrei G.Pakhomov,et al.A new pulsed electric field therapy for melanoma disrupts the tumor’s blood supply and causes complete remission without recurrence[J].Int J.Cancer,2009,125:438-445

[11] Salomskaite-Davalgiene S,VenslauskasMS,Pauziene N.Histological analysis of electrochemotherapy influence in Lewis lung carcinoma[J].Medicina (Kaunas),2002,38(5):540-544.

[12] 姚陈果.可控陡脉冲对恶性肿瘤细胞不可逆性电穿孔的试验和机理研究[J].重庆: 重庆大学学报,2003,89-101.

[13] 姚陈果等.陡脉冲电场对荷瘤BALB/c小鼠癌细胞杀伤效应和抑制作用的实验研究[J].中国生物医学工程学报,2004,27(2):537-543.