转染神经生长因子基因的腹腔移植微囊化细胞对缺氧缺血性脑病新生大鼠脑损伤的保护作用

许 忠，张 磊，郑百红，苟伟会，徐晓恒，车广华，田 昕

（吉林大学第二医院儿科，吉林 长春130041）

转染神经生长因子基因的腹腔移植微囊化细胞对缺氧缺血性脑病新生大鼠脑损伤的保护作用

许 忠，张 磊，郑百红，苟伟会，徐晓恒，车广华，田 昕

（吉林大学第二医院儿科，吉林 长春130041）

目的：探讨腹腔移植微囊化神经生长因子 （NGF）基因3T3细胞对缺氧缺血性脑病 （HIBD）新生大鼠脑损伤的保护作用，为寻找治疗新生儿HIBD的有效方法提供实验依据。方法：新生Wistar大鼠60只，随机分为假手术组、空囊组和移植组，每组20只。假手术组大鼠腹腔注射生理盐水，空囊组大鼠制备HIBD模型后腹腔注射空微囊，移植组大鼠制备HIBD模型后腹腔注射微囊化3T3细胞。分别观察各组新生鼠脑组织水含量和海马区阳性细胞凋亡率。结果：空囊组和移植组大鼠存在不同程度脑水肿，空囊组大鼠脑组织含水量高于假手术组 （P＜0.05），移植组大鼠脑组织含水量与假手术组比较差异无统计学意义 （P＞0.05），但低于空囊组（P＜0.05）。TUNLE免疫组织化学，空囊组与假手术组比较细胞凋亡率差异具有统计学意义 （P＜0.05），移植组阳性细胞凋亡率低于空囊组 （P＜0.05）。结论：腹腔移植微囊化NGF基因3T3细胞可以减轻大鼠HIBD后脑水肿，且对大鼠HIBD后海马神经元有保护作用。

微囊；神经生长因子；新生鼠；缺氧缺血性脑病；脑水肿；细胞凋亡

缺 氧 缺 血 性 脑 病 （hypoxic－ischemic brain damage，HIBD）是由多种围生期因素所致的一种中枢神经系统损伤性疾病，常留有严重神经系统后遗症，25%以上的患儿遗留永久的神经心理缺陷，如脑瘫、精神发育障碍、学习困难和癫痫［1］。HIBD的发生机制复杂，涉及能量代谢、细胞内钙离子超载、兴奋性氨基酸的神经毒性、一氧化氮和缺血再灌注时氧自由基的损伤以及由此导致的神经细胞凋亡［2］。目前公认神经生长因子 （nerve growing factor，NGF）对神经元有营养作用，可促进受损神经元再生，对缺血缺氧的神经具有重要保护作用和修复作用［3］。由于中枢神经系统的特殊组织结构限制了NGF的应用，国内外报道NGF多采用颅内给药的方式，其缺点是给药量受限、损伤大，因此外周合适的给药途径是目前研究的热点。本实验旨在利用免疫隔离技术持续外周给予大鼠NGF，探讨NGF对HIBD新生大鼠脑组织的保护作用，为NGF临床治疗HIBD提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂 出生后7dWistar大鼠共60只，体质量12～18g，雌雄各半。TUNEL试剂盒由上海兰基生物科技有限公司提供。

1.2 表达NGF基因细胞的构建、微囊化及培养

转染NGF的3T3细胞购自中科院大连化学物理研究所生物医用材料工程组，参照该实验室的方法［4］制备海藻酸钠－聚赖氨酸－海藻酸钠 （alginatepoly－l－lysne－alginate，APA）胶囊，将转染 NGF的3T3细胞微囊化并进行体外培养。

1.3 细胞活化性和功能检测将培养后的微囊化细胞洗去培养液，用0.01%丫啶橙生理盐水溶液孵育5min，PBS冲洗，利用激光扫描共聚焦显微镜 （confocal laser scanning microscopy，CLSM ）（气冷式氪－氩离子混和激光管，激发波长488nm，发射波长500～530／560～620nm）观察，采用ELISA法测定微囊化转染3T3细胞分泌的NGF含量，严格按照说明书操作［5］（以上过程在大连化学物理研究所生物医用材料工程组内完成）。

1.4 动物模型的制备 新生鼠水合氯醛腹腔麻醉后，仰卧固定于手术板上，乙醇局部消毒，颈部正中切口，游离右颈总动脉，0号线结扎，6－0线一次性缝线缝合颈部正中切口，即将缺血后新生鼠置入自制常压缺氧舱。缺氧舱大小为50cm×50cm×60cm，留有2个2cm×2cm小孔与外界相通，舱内有电热毯控制舱温，钠石灰吸收舱内水分和CO2。将手术后新生大鼠置于由氮气和空气调节、测氧仪监控的常压缺氧舱内 ［舱温 （36±1）℃，氧浓度0.08%］，2h后取出［5］。模型成功判定标准：新生大鼠在缺氧开始后30～60min均出现皮肤青紫、摇头、肢体抖动、前爪拍头、抽搐和昏迷等表现则认为造模成功，纳入实验。假手术组大鼠作颈部正中切口，游离右颈总动脉，不结扎该动脉，6－0线一次性缝线缝合颈部正中切口，不置入缺氧仓。

1.5 动物分组及给药 60只大鼠随机分成假手术组、空囊组和移植组，每组20只。假手术组大鼠：腹腔注射生理盐水；空囊组大鼠：制备缺氧模型，腹腔注射空微囊；移植组大鼠：制备缺氧模型，腹腔注射微囊化3T3细胞。空囊组和移植组大鼠出舱后30min分别给予腹腔注射空微囊、微囊化3T3细胞，每只0.3mL。

1.6 动物灌注固定及脑标本制备 3组大鼠上述处理后分笼常规饲养，手术后7d应用10%水合氯醛每只0.2mL麻醉各组剩余10只新生大鼠，将大鼠四肢固定于手术板上，切开胸腔后暴露心脏，以穿刺针穿至左心室，并切开右心房，以0.9%生理盐水灌洗，至灌流出液体清亮为止，然后以4%多聚甲醛液灌注，3～5min后新生大鼠出现四肢抖动、强直、头向后仰和似角弓反张样，迅速断头取脑。将脑组织置于4%多聚甲醛溶液中固定2周。取出固定后的脑组织，以视交叉、乳头体中部、大脑后缘与小脑连接处为切点，将脑冠状切成4片，常规石蜡包埋，选取杏仁裂冠状切面进行切片（5μm），取额叶皮质和海马区同一部位的连续切片，编号后置于4℃冰箱中保存备用。各组标本取海马CA1区相同部位石蜡切片1张，进行苏木精－伊红染色。在200倍光镜下观察普通染色下脑组织病理表现。

1.7 脑组织含水量测定 各组中随机取10只新生大鼠，断头取脑，分析天平称质量，80℃烘干至恒质量时称干质量。计算脑组织含水量＝ （湿质量－干质量）／湿质量×100%。

1.8 细胞凋亡率的测定 采用标准TUNLE制作方法。各组标本取海马同部位组织切片，常规脱蜡至水。蒸馏水洗涤2min×3次。标本切片加1∶200新鲜稀释蛋白酶于37℃消化10min。0.1mol·L－1TBS洗2min×3次。每个标本片加标记缓冲液20μL，以保持切片湿润。按每片取TDT和地高辛的dUTP各1μL，加入标记缓冲液中摇匀。甩去切片上多余液体后加标记液20μL至样品湿盒中，37.0℃标记2h。0.1mol·L－1TBS洗2min×3次。加封闭液50μL，室温30min，甩掉封闭液。生物素化抗地高辛抗体50μL，加至标本片上，置样品于湿盒中，37.0℃、30min。0.1mol·L－1TBS洗2min×3次。取1mL 0.1mol·L－1TBS加链霉亲和素－过氧化物酶 （SABC）10μL，混匀后加至切片。37.0℃、30min。0.1mol·L－1TBS洗5min×4次。取1mL蒸馏水分别加入DAB试剂盒中，A、B、C试剂各1滴加至标本片上，显色10～30min，水洗。苏木素复染，0.1mol·L－1TBS和蒸馏水冲洗，脱水，透明，封片，显微镜观察。以不含Bio－dUTP的TDT反应液做阴性对照，检测TUNLE的特异性。细胞凋亡率＝凋亡阳性细胞／总细胞数×100%。每张切片分别测5个视野，取平均值。

1.9 统计学分析 采用SPSS 11.0统计软件包进行数据分析。脑组织含水量和凋亡细胞数量以±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间比较采用q检验。

2 结 果

2.1 各组新生大鼠脑组织含水量的比较 空囊组大鼠脑组织含水量高于假手术组 （P＜0.05），移植组脑组织含水量与假手术组比较差异无统计学意义 （P＞0.05），但低于空囊组，差异具有统计学意义 （P＜0.05）。见表1。

2.2 TUNEL法检测凋亡阳性细胞 TUNEL染色后光镜下可见凋亡阳性细胞改变，缺血缺氧（HI）后海马CA1区可见较多凋亡细胞，空囊组与假手术组海马CA1区细胞凋亡率比较差异具有统计学意义 （P＜0.05）。200倍光镜下见细胞染为核棕色即为阳性凋亡细胞，提示新生大鼠HI后神经细胞有凋亡发生；移植组TUNEL染色阳性细胞百分数低于空囊组，差异具有统计学意义 （P＜0.05）。见表1和图1（插页二）。?

表1 新生大鼠HI后7d脑组织含水量及细胞凋亡率比较Tab.1 Comparisons of water contents in brain tissue and apoptotic rates of new－born rats 7dafter HI（n＝10，±s，η／%）

表1 新生大鼠HI后7d脑组织含水量及细胞凋亡率比较Tab.1 Comparisons of water contents in brain tissue and apoptotic rates of new－born rats 7dafter HI（n＝10，±s，η／%）

＊P＜0.05compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with blank capsule group.

totic rate Sham op Group Water content Apop eration 80.75±1.70 3.2±1.6 Blank capsule 86.28±2.61 49.6±2.7 Transplant 80.27±0.97＊△ 30.2±2.2＊△

3 讨 论

NGF是神经系统最重要的生物活性因子之一，具有维持交感神经和感觉神经细胞功能、促进神经细胞分化、决定轴突生长方向、促进周围神经再生、促进损伤的中枢神经和外周神经修复、维持生存和诱导突起生长的作用［6－7］。NGF对中枢神经的保护作用已成为目前研究的热点。目前中枢神经系统的NGF临床应用存在很多限制，如NGF为蛋白质，不适合经过消化道口服途径给药；NGF半衰期短，需要反复、多次给药；中枢系统局部给药空间小，损伤大。黄英等［8］已证实：NGF可以透过HIBD新生鼠的血脑屏障，为外周治疗中枢神经系统损伤提供了有力的依据。APA微囊除具有稳定性外，本身无免疫原性，具有良好的生物相容性［9］，可将宿主体内对微囊内组织细胞产生的免疫活性物质阻隔在微胶囊外，从而减轻宿主对移植物的免疫排斥反应，同时允许细胞生存所需营养物质以及细胞分泌的活性物质进入和扩散出微囊。

脑水肿为HIBD主要的病理改变，尤以额叶白质区、海马区对脑水肿最敏感［10］。脑组织HI可引起瀑布式连锁反应，加重脑水肿。脑组织含水量是反映脑水肿的重要指标，本研究发现移植组大鼠脑组织含水量与假手术组比较差异无统计学意义，但低于空囊组，表明NGF治疗后可能减轻HIBD后脑水肿的程度。

HIBD是新生儿死亡和婴幼儿神经系统功能障碍的主要原因，HIBD发生的原因主要是脑缺血－再灌注损伤，包括缺血期原发损伤和再灌注后的继发损伤。近年来许多研究［11］表明：全脑或局部脑缺血引起神经元死亡以凋亡为主。各种动物实验［12］表明：脑损伤后4～6h细胞凋亡即开始出现，凋亡高峰出现在损伤后48～72h。迟发性脑细胞凋亡是加重脑损伤的一个因素。因此，寻求抑制神经细胞凋亡的干预措施将成为HIBD治疗的转折点。本实验结果显示：移植组大鼠染色阳性细胞低于空囊组，表明应用腹腔注射微囊化3T3细胞产生的NGF可减轻脑细胞的凋亡进而减轻脑损伤，起到保护脑组织的作用。移植组大鼠海马CA1区凋亡阳性细胞高于假手术组，表明应用腹腔注射微囊化3T3细胞的NGF治疗可减轻凋亡的程度，但是并不能完全阻止HIBD后凋亡的级联反应。NGF通过抑制毒性氨基酸的释放，抑制钙离子的超载，抑制超氧自由基的释放，抑制细胞凋亡，防止和减轻继发的损害［13］。刁士元［14］认为：外源性NGF明显减少了脑缺血－再灌注后细胞凋亡的发生，减轻神经系统损伤，对受损神经元起到全面而持久的保护作用。

［1］龙 琦，尹晓娟，封志纯，等.神经生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对缺氧缺血脑损伤新生大鼠内源性神经干细胞的影响 ［J］.实用医学杂志，2009，25 （1）：36－39.

［2］胡亚美，江载芳.诸福棠实用儿科学 ［M］.7版.北京：人民卫生出版社，2005.

［3］张素芬，尹怀清，常 霞，等.神经生长因子对新生大鼠缺血缺氧性脑损伤后脑组织Fas／FasL表达的影响 ［J］.中国药物与临床，2010，4 （10）：391－392.

［4］雄 鹰，于炜婷，王 为，等.移植用微囊化神经／组织制备及运输的实验研究 ［J］.中国康复理论与实践，2002，8 （5）：296－297.

［5］魏 泓，孙敬方.医学实验动物学 ［M］.成都：四川科学技术出版社，1998.

［6］Gomazkov OA.Nurotrophic and growth factors of the brain：Regulatory specificity and therapeutic potential［J］.Usp Fziol Nauk，2005，36 （2）：22－40.

［7］Meng M，Zhiling W，Hui Z，et al.Cellular levels of TrkB and embryornic rat cortical neurons against hypoxiainvitro［J］.Int J Dev Neurosci，2005，23 （6）：515－521.

［8］黄 英，严超英.碘标记神经生长因子在缺氧新生鼠脑内的吸收 ［J］.实用儿科临床杂志，2006，21 （11）：699－670.

［9］李洪波，江 红，段翠密，等.BPA微囊与APA微囊机械强度和生物相容性的比较研究 ［J］.组织工程与重建外科杂志，2006，2 （2）：70－72.

［10］蒋 犁，黄 莉，吴明赴，等.新生儿缺血缺氧性脑病时脑血流动力改变 ［J］.临床儿科杂志，2004，72 （14）：802－803.

［11］汪敬业.成年大鼠全脑严重缺血诱导的神经元死亡机制及3－甲基腺嘌呤的作用研究 ［D］.杭州：浙江大学，2010.

［12］Nakashima K，Yamashita K，Uesuge S，et al.Temporal and spatial profile of apoptotic cell death in transient intracerebral mass lesion of the rat［J］.Neurotrauma，1999，16 （2），143－151.

［13］张涵亮，陈 俊.神经生长因子修复周围神经的临床疗效观察 ［J］.吉林大学学报：医学版，2011，37（2）：303.

［14］刁士元.神经生长因子对大鼠局灶性脑缺血再灌注后细胞凋亡的影响 ［J］.临床神经病杂志，2004，17（6）：450－451.

Protective effect of celiac transplanting micro－capsulated cells transfected by nerve growing factor gene on hypoxic－ischemic brain damage in new－born rats

XU Zhong，ZHANG Lei，ZHENG Bai－hong，GOU Wei－hui，XU Xiao－heng，CHE Guang－hua，TIAN Xin
（Department of Pediatrics，Second Hospital，Jilin University，Changchun 130041，China）

ObjectiveTo discuss the protective effect of celiac transplanting micro－capsulated 3T3cells transfected by nerve growing factor（NGF）gene on hypoxic－ischemic brain damage （HIBD）in new－born rats，and to provide experimental basis for HIBD treatment.Methods60new－born Wistar rat，were randomly divided into sham operation group（n＝20），blank capsule group （n＝20），and transplant group （n＝20）.The rats in sham operation group were injected with saline.The rat models of HIBD were set up and used in blank capsule group and transplant group.The rats in blank capsule group were transplanted with blank capsules.The rats in transplant group were treated by transplanting micro－capsulated 3T3cells transfected by NGF gene.The changes of water contents and the apoptotic rates of rat neuron in each group were analyzed.ResultsThe rats in blank caspsule and transplant groups had various degrees of hydrocephalus，the water content in brain tissues of rats in blank capsule group was higher than that in sham operation group （P＜0.05）.The water content in brain tissues of rats in transplant group had no significant difference compared with sham operation group （P＞0.05），but it was lower than that in blank capsule group （P＜0.05）.The TUNLE immunohistochemistry results showed that there was significant difference of apoptotic rate of neuron between blank capsule group and sham operation group（P＜0.05），and the apoptotic rate of rat neuron in transplant group was lower than that in blank capsule group （P＜0.05）.ConclusionCeliac transplanting of micro－capsulated NGF 3T3cells can relieve the hydrocephalus after HIBD and protect the hippocampal neuron after HIBD.

micro－capsulate；nerve growing factor；new－born rats；hypoxic－ischemic brain damage；hydrocephalus；apoptosis

R743.31

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1110－04

2011－07－15

吉林省科技厅科研基金资助课题 （20070426－2）

许 忠 （1959－），男，吉林省敦化市人，教授，医学硕士，主要从事小儿神经系统疾病方面的研究。

苟伟会 （Tel：0431－88796802，E－mail：gouweihui＠163.com）