人乳头瘤病毒及p16基因的表达与外阴癌变的关系

李 琴

(宁夏回族自治区人民医院 宁夏银川 750021)

p16是一种抑癌基因，其编码的蛋白可与cycline-D1竞争性结合CDK4，从而抑制CDK4。Cycline-D1激酶的催化活性，抑制pRb蛋白的磷酸化，使其不能释放E2F因子，细胞分裂不能通过G1-S调控点，阻止细胞无限增殖［1］。人类多种肿瘤中都发现存在p16基因异常。人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)目前被认为是宫颈癌的致瘤病毒，其编码的E6、E7蛋白可与p53等多种抑癌基因结合使其失活，导致细胞异常增生。外阴恶性肿瘤发病率较低，近年来也有上升趋势，多数为外阴鳞状细胞癌(vulvar squamous cell cancer，VSCC)，外阴疣状癌和基底细胞癌较少。疣状癌虽为鳞癌的特殊亚型，但其临床特点与基底细胞癌相似。本研究探讨正常外阴皮肤、外阴鳞癌、外阴基底细胞癌及疣状癌中p16基因的表达缺失与HPV感染的情况，旨在探讨其间关系。

1 材料与方法

1.1 材料 选取我院妇科1990～2009年门诊活检及手术切除，经病理证实为外阴癌的石蜡标本88例，其中VSCC48例，基底细胞癌20例，疣状癌20例及正常外阴皮肤20例。DNA提取试剂盒;p16引物:上游5＇-cctggetetgaccattetgt-3;下游5-gtectcacetgagggacctt-3［2］;HPV16 引物:上游 5＇-ggcttttgacagttaataca-3;下游5-attagtgattatagaeatta-3(购自上海生工试剂公司)。PCR反应试剂盒(购自大连宝生物试剂公司)。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取。石蜡切片10um5～7片约25mg置入1.5mL PCR试管中，加二甲苯1mL水浴60℃30 min，3 000 r/min离心10 min后去上清，重复一次以除去石蜡。后加入无水乙醇1mL充分振荡，3 000r/min离心10 min后去上清，重复1次以脱水及残存的二甲苯。室温放置10 min挥发残余的乙醇后，按照DNA提取试剂盒说明书进行。

1.2.2 PCR扩增。将DNA提取液即模版3μL加入到按照试剂盒说明配置的25μL反应体系内，含上下游引物各1μL(浓度为25pmol/L)。扩增程序为:p16 94℃60s、55℃45s、72℃30s 共 30个循环后72℃延伸10min，产物为347bp;HPV16 94℃60s、55℃60s、72℃90s共30个循环后72℃延伸5min，产物为335bp;βactin内对照无特异程序，产物为250 bp。阳性对照应用已知p16阳性的正常皮肤组织DNA模板和HPV阳性的宫颈癌DNA模板代替样本模板;阴性对照应用DEPC处理的双蒸水代替样本模板。

1.2.3 产物判定。向25μL产物内加入3μL Loading buffer(上样缓冲液)混匀，取出15μL加入含EB的2%琼脂糖凝胶孔中进行电泳，40 min后于紫外灯下进行观察并拍照。

1.3 统计学处理 计算基因阳性表达率，并进行比较，按χ2检验行统计学分析，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 p16和HPV16在外阴癌及癌前病变中的检测情况

2.1.1 p16基因的阳性表达率。外阴正常皮肤中p16基因的阳性表达率为100%，在VSCC中p16基因的阳性表达率为27.08%，相比差异有显著性(P＜0.05)。基底细胞癌和疣状癌中未检出p16基因。见表1。

2.1.2 HPV16 DNA的阳性表达率。外阴正常皮肤中未检出HPV16 DNA，在基底细胞癌中为85%，疣状癌中为90%，在VSCC中未检出HPV16 DNA。见表1。

表1 p16基因、HPV16的检出情况(例)

2.2 p16与VSCC临床病理特征的关系 p16基因表达与临床分期、病理分级、淋巴结转移有关，差异均有显著性(P＜0.05)。见表2。

表2 p16基因阳性表达率与VSCC临床病理特征的关系(例)

3 讨论

p16基因的抑癌作用在于它抑制了CDK4，影响细胞从G1-S期的转变，使细胞停留在G1期［3］。本研究从正常皮肤到VSCC，p16基因阳性表达率明显降低，提示外阴鳞状上皮细胞出现异型性时，就有p16基因的部分表达缺失，当细胞发生癌变时，p16基因表达缺失明显增加。说明VSCC与p16基因表达缺失有关。在基底细胞癌和疣状癌中未检出p16基因，可能p16基因几乎全部表达缺失，这两种癌与p16基因表达缺失关系更密切。HPV与宫颈癌发生的关系已经明确，但与外阴癌变的关系尚不能肯定。因此，本研究拟在探讨HPV感染是否与外阴癌变有关。研究中发现正常皮肤中未检出HPV感染，HPV16在VSCC未检出，但基底细胞癌和疣状癌中的HPV阳性表达率分别为85%和90%，提示它们与HPV感染有关。

研究中还发现，在VSCC中，Ⅲ～Ⅳ期癌较I～Ⅱ期癌p16基因的表达缺失率高，中、低分化较高分化高，有淋巴结转移的较无转移高，提示随着肿瘤的临床分期增加、分化程度降低和有淋巴结转移时，p16基因表达缺失率明显增加，p16基因的表达缺失在外阴癌的发展过程中也起到重要的作用，与肿瘤的恶性进展有关。这与HELGAB［4］等在子宫内膜癌等其他恶性肿瘤中p16基因表达缺失的报道一致。

在基底细胞癌和疣状癌中，p16基因全部表达缺失，HPV感染的阳性率均非常高，进一步提示HPV感染在基底细胞癌和疣状癌中可能导致了p16基因表达缺失。然而，此结论与以往应用免疫组化方法研究的结论不一致，在与HPV有关的恶性肿瘤中，如口腔疣状癌和宫颈鳞状细胞癌［5］，p16蛋白往往呈过表达。但p16蛋白的过度表达可能无抑癌活性，一方面p16的正常抑癌活性往往需要pRb正常功能的存在，而HPV的E7可使pRb失去正常的功能或使之降解;另一方面RUHUL［6］等发现HPV感染后，p16蛋白虽过度表达但其功能及结构已发生改变，可能与p16基因的甲基化和突变有关。所以，HPV16的感染与p16基因的表达缺失在癌变的过程中可能有协同作用，但其具体机制和作用关系还需进一步探讨。

［1］LUKAS J，AAGAARD L，STRAUSS M，et a1.Oncogenic aberrations of p16 ink4/CDKN2 and cyelinD1 cooperate to deregulate G1 control［J］.CancerRes，1995，55(21):4818

［2］李福才，李英慧，赵 旭.喉癌中p15、p16基因纯合缺失与EGFR基因扩增相关性研究［J］.遗传学报，2004，31(2):109

［3］SERRANO M，HANNON GT，REACH D.A new regulatory motify in cell cycle control causing specific inhibition of cyclinD/CDK4［J］.Nature，1993，366(6456):704

［4］HELGAB S，SOMA D，LARS A.Loss of nuclear p16 protein expression is not associated with promoter methylation but defines a subgroup of aggressive endometrial carcinomas with poor prognosis［J］.Clin Cancer Res，2000，6(8):153

［5］邹 萍，唐瞻贵，冯德云.人乳头状瘤病毒16/18型、p53、p16蛋白在口腔疣状癌中的表达［J］.口腔颌面外科杂志，2003，13(3):211

［6］RUHUL QUDDUS M，XU C，STEINHOFF MM，et a1.Simplex(differentiated)type VIN:absence of p16 INK4 supports its weak association with HPV and its probable precursor role in non-HPV related vulvar squamous cancers［J］.Histopathology，2005，46(6):718