结核分枝杆菌MycP1蛋白的原核表达及其对巨噬细胞的毒性作用*

黄丹丹，鲍 朗，杨晓玲，邓仪昊，廖 丹

四川大学华西基础医学与法医学院感染免疫研究室成都 610041

#通讯作者，男，1954年6月生，博士，教授，研究方向:分子感染免疫，E-mail:baolang@scu.edu.cn

结核分枝杆菌MycP1蛋白的原核表达及其对巨噬细胞的毒性作用*

黄丹丹，鲍 朗#，杨晓玲，邓仪昊，廖 丹

四川大学华西基础医学与法医学院感染免疫研究室成都 610041

#通讯作者，男，1954年6月生，博士，教授，研究方向:分子感染免疫，E-mail:baolang@scu.edu.cn

结核分枝杆菌;MycP1;巨噬细胞;细胞毒性

目的:构建结核分枝杆菌MycP1蛋白原核表达系统。方法:构建pGEX-4T-1-Rv3883c重组质粒，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达，采用SDS-PAGE和Western blot法检测目标蛋白的表达情况。目标蛋白经亲和层析纯化后，以不同质量浓度MycP1作用于小鼠巨噬细胞ANA-1，48 h后XTT法检测活细胞数，同时测定细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活力，以评价其细胞毒性。结果:成功构建pGEX-4T-1-Rv3883c质粒，该质粒能在大肠杆菌中表达，经鉴定，表达的融合蛋白为目标蛋白MycP1。该融合蛋白作用后可使ANA-1活细胞数下降(F=34.327，P＜0.001)，培养上清液中LDH活力升高(F=336.720，P＜0.001)。结论:成功构建了MycP1原核表达系统，目标蛋白对巨噬细胞有一定的毒性效应。

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)引起的重大传染病。近年来，由于多重耐药和极端耐药结核菌株的出现以及与人类免疫缺陷病毒(HIV)的交叉感染等因素，结核病的发病率和病死率持续增加［1］，结核病流行呈现显著上升趋势［2-4］。因此，对结核分枝杆菌致病机制的研究具有重要的现实意义。

细菌的致病性依赖于其分泌毒力因子的能力。结核分枝杆菌具有高度复杂的细胞壁结构，其胞内蛋白必须通过细胞壁结构才能分泌至胞外环境，目前已报道［5-7］的分泌途径有常规分泌途径、双精氨酸转运系统和ESX-1分泌系统，其中ESX-1分泌系统在结核分枝杆菌致病过程中发挥重要作用。枯草杆菌样丝氨酸蛋白酶MycP1是ESX-1系统的重要调节酶，该酶存在于结核分枝杆菌的细胞壁或膜上，由Rv3883c编码，是ESX-1系统不可缺少的组成部分，而且是巨噬细胞感染早期不可缺少的毒力因子，也是目前结核药物研发的重要靶点［8-10］。在卡介苗中Rv3883c同源基因不表达相关蛋白［11］。作者从结核分枝杆菌毒力株 H37Rv基因组中克隆、表达Rv3883c基因，将目的蛋白作用于小鼠巨噬细胞，观察其细胞毒性效应，为进一步研究MycP1的功能及结核分枝杆菌的致病机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒和菌株 原核表达质粒pGEX-4T-1、结核分枝杆菌H37Rv基因组及小鼠骨髓巨噬细胞株ANA-1均由该研究室常规保存。感受态细胞E.coli BL21(DE3)pLysS购自Tiangen公司。

1.1.2 主要试剂 引物均由上海Invitrogen公司合成;Prime STAR高保真Taq DNA聚合酶、PCR试剂盒和DNA连接试剂盒购自TaKaRa公司;DNA限制性核酸内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ以及标准品购自Ferments公司;其余质粒提取试剂盒、胶回收及PCR产物纯化试剂盒、抗GST蛋白的单克隆抗体、羊抗鼠IgG-HRP二抗、蛋白纯化柱、乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒、四氮唑复合物(XTT)、硫酸酚嗪甲酯(PMS)与文献［12］相同。

1.2 pGEX-4T-1-Rv3883c质粒的构建及鉴定根据GenBank中的Rv3883c基因序列［13］，通过Primer Primer 5.0软件设计引物。Rv3883c基因上游引物(P1)序列 5’-GCgaattcCCCGCATCGGCCATCACG-3’，下游引物(P2)序列 5’-TTctcgagTCATCGGCG GCTCAGCG-3’(小写部分为酶切位点)。PCR扩增体系为:H2O 32.5 μL，5×PrimerSTAR Buffer(Mg2+plus)10 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)4 μL，P1、P2各1 μL，H37Rv基因组DNA 1 μL，Primer-STAR HS 0.5 μL，于Eppendorf Mastercycler Gradient PCR扩增仪上进行扩增。反应参数:94℃预变性5 min;98℃变性10 s，61℃ 退火45 s，72℃延伸30 s，30个循环;72℃延伸2 min。产物经琼脂糖凝胶电泳检测，按DNA胶回收试剂盒说明进行纯化，分别用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切纯化产物和pGEX-4T-1质粒，回收酶切产物连接后转化感受态细胞，挑取阳性克隆进行双酶切鉴定、PCR鉴定和基因测序。

1.3 MycP1蛋白的原核表达和纯化挑取单一克隆接种于5 mL含100 mg/L Amp的LB培养基，振荡培养过夜后次日接种于相同培养基中，振荡培养8 h后加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG，25℃继续诱导培养过夜。离心收集菌体，分别取上清和沉淀行SDS-PAGE电泳后，半干转移仪转膜，先后加入一抗(按1∶10 000稀释的鼠抗GST单克隆抗体)、二抗(按1∶5 000稀释的羊抗鼠IgG-HRP)后DAB显色。采用GSTrap亲和层析柱纯化融合蛋白，操作按产品说明书进行。以BL21、BL21/pGEX-4T-1为对照。

1.4 MycP1融合蛋白对ANA-1细胞增殖的影响

1.4.1 ANA-1活细胞数的测定 采用XTT比色实验，方法见文献［10］。收集ANA-1细胞，调整细胞数为1×105mL－1，按100 μL/孔接种于96孔板中，加入融合蛋白至终质量浓度分别为0、1、5、10、20、40 mg/L，每个质量浓度重复5孔。37℃、体积分数5%CO2条件下培养48 h后，滴加XTT和PMS混合液，继续培养4 h，在450 nm波长测定吸光度值，以此表示活细胞数。

1.4.2 细胞培养上清中LDH活力的测定 将 ANA-1细胞接种至106个/孔的6孔板中，36 h后加入融合蛋白至终质量浓度分别为0、1、5、10、20、40 mg/L，每一质量浓度重复5孔。48 h后检测培养上清中LDH活力，具体操作按试剂盒说明书进行。

1.5 统计学处理采用SPSS 13.0处理数据，组间活细胞数和培养上清中LDH活力的比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 pGEX-4T-1-Rv3883c质粒的鉴定以H37Rv基因组DNA为模板，以引物P1、P2进行PCR扩增，得到大小约1 300 bp的特异性片段，与预期目的基因片段大小相符(图1)。pGEX-4T-1-Rv3883c鉴定结果见图2，测序结果显示连接方向为正向连接，含有目的基因完整读码框序列。

图3 融合蛋白的表达

2.2 MycP1融合蛋白的表达、纯化与鉴定pGEX-4T-1-Rv3883c阳性克隆经IPTG诱导表达后，进行SDS-PAGE分析，结果显示，在约74 000的相对分子质量处出现一条明显的蛋白表达条带。该融合蛋白在胞内以可溶形式表达，取裂解液上清后以亲和层析柱纯化，获得了高纯度的融合蛋白(图3)，Western blot鉴定为MycP1(图4)。

图4 融合蛋白的免疫印迹分析

2.3 不同质量浓度MycP1作用后ANA-1活细胞数和培养上清中LDH活力测定结果见表1。

表1 不同质量浓度MycP1作用后ANA-1活细胞数及培养上清中LDH活力比较

3 讨论

该研究中，作者成功克隆、表达了结核分枝杆菌毒力株H37Rv的Rv3883c基因，获得高纯度的MycP1融合蛋白。LDH广泛存在于生物细胞内，当细胞受损伤或死亡时，可释放到细胞外，使细胞培养上清液中LDH活性升高，现在已成为公认的反映细胞损伤的指标［12］。该蛋白作用于ANA-1细胞后，细胞活细胞数明显下降，培养上清中LDH活力明显升高，说明ANA-1受损，LDH释放增多。研究结果表明，成功制备了MycP1蛋白的原核表达系统，表达的MycP1蛋白对细胞具有毒性作用。这为进一步研究该蛋白的功能及其在整个结核病中的致病作用奠定了基础。

该实验在大肠杆菌内融合表达Rv3883c编码的MycP1蛋白。在之前的实验中，作者发现Rv3883c的N末端存在由21个氨基酸组成的信号肽序列，影响了蛋白表达。因此在该研究中，作者将其转化入大肠杆菌中进行诱导表达(IPTG终浓度为0.1 mmol/L)，经SDS-PAGE电泳分析，表明该重组质粒经IPTG诱导后能在大肠杆菌中表达相对分子质量为74 000的融合蛋白，这可能与该基因信号肽序列的去除相关。

［1］Global tuberculosis control:a short up date to the 2009 report［R/OL］.Geneva:World Health Organization，2009.

［2］Prasad R.Multidrug and extensively drug-resistant TB (M/XDR-TB):problems and solutions［J］.Indian J Tuberc，2010，57(4):180

［3］Lazarus JV，Olsen M，Ditiu L，et al.Tuberculosis-HIV co-infection:policy and epidemiology in 25 countries in the WHO European region［J］.HIV Med，2008，9(6):406

［4］Pereira M，Tripathy S，Inamdar V，et al.Drug resistance pattern of Mycobacterium tuberculosis in seropositive and seronegative HIV-TB patients in Pune，India［J］.Indian J Med Res，2005，121(4):235

［5］李浩，徐俊杰，陈薇.结核分枝杆菌ESX分泌系统研究进展［J］.中国科学C辑:生命科学，2009，39(10):925

［6］Tan T，Lee WL，Alexander DC，et al.The ESAT-6/CFP-10 secretion system of Mycobacterium marinum modulates phagosome maturation［J］.Cell Microbiol，2006，8(9):1417

［7］Stanley SA，Johndrow JE，Manzanillo P，et al.The typeⅠIFN response to infection with Mycobacterium tuberculosis requires ESX-1-mediated secretion and contributes to pathogenesis［J］.J Immunol，2007，178(5):3143

［8］Dave JA，Gey Van Pittius NC，Beyers AD，et al.Mycosin-1，a subtilisin-like serine protease of Mycobacterium tuberculosis，is cell wall-associated and expressed during infection of macrophages［J］.BMC Microbiol，2002，2:30

［9］Brown GD，Dave JA，Gey van Pittius NC，et al.The mycosins of Mycobacterium tuberculosis H37Rv:a family of subtilisinlike serine proteases［J］.Gene，2000，254(1/2):147

［10］Ohol YM，Goetz DH，Chan K，et al.Mycobacterium tuberculosis MycP1 protease plays a dual role in regulation of ESX-1 secretion and virulence.cell［J］.Cell Host Microbe，2010，7(3):210

［11］Lewis KN，Liao R，Guinn KM，et al.Deletion of RD1 from Mycobacterium tuberculosis mimics bacille Calmette-Guerin attenuation［J］.J Infect Dis，2003，187(1):117

［12］张英，鲍朗，朱海龙，等.赖型钩端螺旋体Loa22重组质粒的蛋白表达和对巨噬细胞的毒性作用［J］.四川大学学报:医学版，2008，39(3):351

［13］Krawczyk J，Kohl TA，Goesmann A，et al.From Corynebacterium glutamicum to Mycobacterium tuberculosis:towards transfers of gene regulatory networks and integrated data analyses with MycoRegNet［J］.Nucleic Acids Res，2009，37(14):e97

Prokaryotic expression of MycP1 of Mycobacterium tuberculosis and its cytotoxicity to macrophages

HUANG Dandan，BAO Lang，YANG Xiaoling，DENG Yihao，LIAO Dan

Research Unit of Infection and Immunity，West China School of Preclinical and Forensic Medicine，Sichuan University，Chengdu 610041

Mycobacterium tuberculosis;MycP1;macrophage;cytotoxicity

Aim:To establish the prokaryotic expression system of MycP1 of Mycobacterium tuberculosis.Methods:Therecombinant plasmid of pGEX-4T-1-Rv3883c was constructed and expressed in E.coli BL21(DE3)，and then induced by IPTG.The product was identified by SDS-PAGE and Western blot and purified with GST-affinity chromatography.The purified protein was applied to mice macrophages ANA-1 cells，and the cytotoxicity was evaluated by detecting LDH activity in culture medium and XTT absorption.Results:The recombinant plasmid pGEX-4T-1-Rv3883c was constructed successfully，and the purified product could decrease XTT absorption(F=34.327，P＜0.001)，increase the level of LDH activity in culture medium of ANA-1 cells(F=336.720，P＜0.001).Conclusion:The prokaryotic expression system of MycP1 has been successfully constructed，and the targeted protein has a toxic effect on macrophages.

R378.91

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.04.004

*国家传染病重大专项基金资助项目 2008ZX10003-013;国家自然科学基金资助项目 30872257

(2011-12-27收稿 责任编辑王 曼)