菝葜治疗便秘型肠易激综合征作用机制的实验研究

2012-07-28马腾飞王业秋李铁男

中国药理学通报 2012年1期

马腾飞，王业秋，张宁，刘影，李铁男

(黑龙江中医药大学附属第一医院消化科，黑龙江哈尔滨 150040)

肠易激综合征(irritablebowelsyndrome，IBS)，是一种非器质性肠道功能紊乱性疾病，以腹痛或腹部不适同时伴排便习惯及大便性状改变为主要症状。传统医学认为 IBS属于腹痛、泄泻、便秘范畴［1］。近年来利用中医中药对IBS的临床治疗取得了很大的进展，在改善症状上疗效显著，且毒副作用小。中药菝葜(Smilax China L)在民间应用历史悠久，临床上常用于治疗痢疾、腹泻、消化不良等。但有关菝葜在治疗消化系统疾病的实验研究较少，而在肠易激综合征药物治疗的实验研究中是以腹泻型肠易激综合征(D-IBS)的研究居多，对便秘型肠易激综合征(C-IBS)治疗药物的研究很少。本实验通过冰水灌胃法建立大鼠C-IBS模型，从血液生化及肠道病理改变等方面探讨菝葜治疗C-IBS的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SD大鼠，♀♂各半，体质量180～220 g，由黑龙江中医药大学动物研究中心提供(动物合格证号:SCXK黑2008004)。

1.1.2 药物及试剂菝葜(北京同仁堂制药集团哈尔滨药店，经黑龙江中医药大学陈孝忠副教授鉴定)，将菝葜粗末按照1∶10的料液比浸泡在70%乙醇中72 h后超声提取，提取液过滤后减压干燥得浸膏，上D101大孔树脂柱进行分离纯化，得50%乙醇大孔树脂洗脱液，干燥、粉碎得固体粉末，置4℃冰箱保存，临用前用蒸馏水配制成浓度为2 g/ml(低剂量组)、4 g/ml(中剂量组)、8 g/ml(高剂量组)混悬液(按生药量计);0.9%NaCl注射液(吉林省广春药业有限公司);西沙必利片(山东龙力药业有限公司，5 mg/片)，临用前蒸馏水配制成浓度为0.4 g·L－1的混悬液;大鼠5-HT、SS、SP 酶联免疫吸附法测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);兔抗鼠5-HT、SS、SP、多克隆一抗(北京博奥森生物技术有限公司)、二抗为PV6001试剂盒(北京中山生物技术有限公司);其他试剂为分析纯。

1.1.3 仪器 KQ5200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);RE5220旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);Multiskan MK3酶标仪(热电上海仪器有限公司);HF-90 CO2培养箱(上海智成分析仪器有限公司);TGL-16G-C高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂);2135型切片机(德国莱卡);美国moticam3000显微摄影成像系统;电热恒温箱(上海一恒);医用微波炉。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立用冰水灌胃法建立C-IBS模型［2］，大鼠单笼独立饲养，每天灌胃给予0～4℃生理盐水2 ml，造模14 d，观察14 d(造模成功的标准为大便干硬，大便含水量降低)。

1.2.2 分组及给药造模成功后，将模型大鼠随机分成模型组、阳性对照组、菝葜提取物高、中、低剂量组，8只/组。另设空白组8只。各给药组按体重20 ml·kg－1灌胃给药，模型组和空白组同步给予生理盐水，按体重20 ml·kg－1。灌胃给药3周开始检测指标。

1.2.3 指标测定末次给药结束6 h后，10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血、取结肠、取脊髓腰膨大段。酶联免疫吸附法检测给药后各组大鼠血清中5-HT含量、血浆中SS、SP含量;对各组大鼠进行结肠5-HT、SS、SP、脊髓腰膨大段SP的免疫组化染色，moticam3000显微摄影成像系统于400倍视野下摄影，每组随机选取10个视野，用Motic image 3.2图像分析软件进行分析，计算平均灰度值(0～255之间);对各组大鼠结肠MC进行甲苯胺蓝染色，用moticam3000显微摄影成像系统于400倍视野下摄影，每组随机选取3个视野，用Motic image 3.2图像分析软件进行计数，取平均值，记录MC每视野数目。观察菝葜提取物对模型组大鼠各个指标的影响，与空白组和模型组相比较。操作严格按照说明书进行。

1.3 统计学处理用SPSS 19.0统计软件进行统计学处理，计量资料用±s表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 菝葜提取物对C-IBS大鼠血清5-HT含量的影响结果见Tab 1。与空白组相比，模型组血清5-HT含量升高(P＜0.01);与模型组相比，各给药组血清5-HT含量均呈下降趋势，其中，阳性对照组和菝葜提取物低剂量组降低(P＜0.05);菝葜提取物低剂量组与阳性对照组作用相当。

Tab 1 Influence of extract of Smilax China L.on content of 5-HT，SP，SS in blood of rats suffering from C-IBS(±s，n=8)

△△P＜0.01 vs blank control group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model group

Group SS content/ng·L －1 5-HT content/ng·L －1 SP content/ng·L －1 Blank control group 121.12 ±6.34 158.31 ±14.47 147.30 ±9.61 Model group 131.65 ±6.12△△ 184.49 ±2.90△△ 135.98 ±7.93△△Active control group 122.97 ±3.96＊＊ 174.18 ±4.74* 145.92 ±3.37*High dose group 129.47 ±8.76 183.03 ±5.43 136.12 ±6.51 Middle dose group 129.15 ±5.26 182.91 ±3.49 134.72 ±5.70 Low dose group 122.80 ±3.95＊＊ 175.03 ±8.46* 144.16 ±4.27*

与空白组相比，模型组血浆SS含量升高(P＜0.01);与模型组相比，各给药组血浆SS含量均呈下降趋势，其中阳性对照组和菝葜提取物低剂量组降低(P＜0.01);菝葜提取物低剂量组与阳性对照组作用相当。

与空白组相比，模型组血浆SP含量下降(P＜0.01);与模型组相比，除菝葜提取物中剂量组外各给药组血浆SP含量均呈上升趋势，而菝葜提取物中剂量组血浆SP含量则减少，其中阳性对照组和菝葜提取物低剂量组升高(P＜0.05)、菝葜提取物中剂量则降低但差异无显著性(P＞0.05);菝葜提取物低剂量组与阳性对照组作用相当。

2.2 菝葜提取物对C-IBS大鼠结肠5-HT、SP、SS免疫组化染色的影响结果见Tab 2。与空白组相比，模型组结肠5-HT免疫组化染色的平均灰度值下降(P＜0.01);与模型组相比，各给药组免疫组化染色的平均灰度值均呈上升趋势，其中阳性对照组和菝葜提取物低剂量组升高(P＜0.01);菝葜提取物低剂量组与阳性对照组作用相当。

Tab 2 Influence of extract of Smilax China L.on average gray value of immunohistochemical staining of C-IBS rats colon(±s，n=8)

△△P＜0.01 vs blank control group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model group

Group 5-HT SP SS Blank control group 169.70 ±3.59 177.80 ±7.04166.70 ±4.83 Model group 150.90 ±11.11△△165.40 ±11.91△△ 155.20 ±9.93△△Active control group 167.60 ±11.4＊＊ 173.80 ±6.34* 165.50 ±5.97＊＊High dose group 154.10 ±4.36 171.20 ±3.58 156.10 ±11.41 Middle dose group 157.30 ±8.81 168.00 ±7.11 157.60 ±8.54 Low dose group 162.50 ±5.84＊＊ 173.60 ±6.93* 164.00 ±4.94*

与空白组相比，模型组结肠SP免疫组化染色的平均灰度值下降(P＜0.01);与模型组相比，各给药组免疫组化染色平均灰度值均呈上升趋势，其中阳性对照组和菝葜提取物低剂量组升高(P＜0.05);菝葜提取物低剂量组与阳性对照组作用相当。

与空白组相比，模型组结肠SS免疫组化染色的平均灰度值下降(P＜0.01);与模型组相比，各给药组免疫组化染色平均灰度值均呈上升趋势，其中，阳性对照组和菝葜有效成分低剂量组升高(P＜0.01，P＜0.05);菝葜提取物低剂量组与阳性对照组作用相当。

免疫组化染色的平均灰度值与其染色强度的表达成反比，即平均灰度值越大染色强度越小，平均灰度值越小，反而染色强度越大。本实验中结肠5-HT、SS、SP的免疫组化染色散在的表达在肠黏膜胞质中，表达的强度呈淡黄、黄色或棕黄色。给药3周后，模型组大鼠结肠5-HT、SS、SP免疫组化的染色强度高于菝葜提取物低剂量组，具有统计学意义，说明了菝葜有效成分低剂量组可以降低模型大鼠结肠5-HT、SS、SP 免疫组化染色的表达。见 Fig 1、2、3。

Fig 1 Influence of extract of Smilax China L.on expression of immunohistochemical staining of 5-HT of C-IBS rats colon

Fig 2 Influence of extract of Smilax China L.on expression of immunohistochemical staining of substance P of C-IBS rats colon

Fig 3 Influnece of extract of Smilax China L.on expression of immunohistochemical staining of SS of C-IBS rats colon Note see Fig 1.

2.3 菝葜提取物对C-IBS大鼠脊髓SP免疫组化染色的影响结果见Tab 3。与空白组相比，模型组脊髓SP免疫组化染色的平均灰度值下降(P＜0.01);与模型组相比，各给药组脊髓SP免疫组化染色的平均灰度值呈上升趋势，其中阳性对照组和菝葜提取物低剂量组脊髓SP免疫组化染色的灰度平均值升高(P＜0.05);菝葜提取物低剂量组与阳性对照组作用相当。

Tab 3 Influence of extract of SmilaxChina L.on average gray value of immunohistochemical staining of C-IBS rats spinal cord(±s，n=8)

△△P＜0.01 vs blank control group;*P＜0.05 vs model group

Group SP Blank control group 166.90 ±5.59 Model group 148.60 ±14.7△△Active control group 158.30 ±7.94*High dose group 148.90 ±8.63 Middle dose group 148.91 ±8.64 Low dose group 158.20 ±8.34*

本实验中脊髓SP的免疫组化染色散在的表达在肠粘膜胞质中，表达的强度呈淡黄、黄色或棕黄色。给药3周后，模型组大鼠脊髓SP免疫组化的染色强度高于低剂量组，具有统计学意义，说明了菝葜有效成分低剂量组可以降低模型大鼠脊髓SP免疫组化染色的表达。见Fig 4。

Fig 4 Influence of extract of Smilax China L.on expression of immunohistochemical staining of SP of C-IBS rats spinal cord

2.4 菝葜提取物对C-IBS大鼠结肠MC计数的影响结果见Tab 4。与空白组相比，模型组结肠MC计数/视野升高(P＜0.01);与模型组相比，各给药组MC计数/视野计数均呈下降趋势，其中阳性对照组、菝葜提取物低剂量组MC计数/视野降低(P＜0.01，P＜0.05);菝葜提取物低剂量组与阳性对照组作用相当。

Tab 4 Influence of extract of Smilax China L.on counting of MCof C-IBS rats colon(±s，n=8)

△△P ＜0.01 vs blank control group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group

Group Counting of MC(Pcs/vision)Blank control group 5.23 ±0.61 Model group 6.13 ±0.91△△Active control group 5.30 ±0.42＊＊High dose group 6.08 ±0.16 Middle dose group 6.07 ±0.23 Low dose group 5.47 ±0.08*

3 讨论

菝葜是被子植物门百合科菝葜属植物，通常以根茎入药，其功效是健脾益气，温肠止泻。中医对于菝葜在治疗风湿方面的论述较多，这一方面的作用也已被人所公认。近年来，关于菝葜治疗泄泻、便秘等脾胃病方面的论述日益增多。本课题组自拟枳术菝葜饮治疗老年慢性功能性便秘取得较好疗效［3］。但只是涉及到了菝葜复方的临床观察，并未涉及菝葜提取物对C-IBS治疗作用机制的研究。

另外本课题组发现，在色谱仪:美国DIONEX P680高效液相色谱仪，色谱柱:Venusil，XBP C18(5 μm，4.6 mm×250 mm，博纳爱杰尔科技有限公司);流动相:乙腈－水溶液(0～60 min乙腈比例5% ～100%);检测波长为290 nm;柱温:25℃;流速:1 ml·min－1;进样量:20 μl的色谱条件下对菝葜提取物的20%醇、50%醇、80%醇洗脱部位进行分析，发现菝葜总提取物20%、50%、80%醇大孔树脂洗脱部位3者组分交叉较少，分离较完全，通过标准品落新妇苷进行对比，落新妇苷主要存在于50%醇大孔树脂洗脱部位中(Fig 5)。而近年来研究表明，落新妇苷具有多种生物学活性，包括镇痛、消炎、杀菌、免疫等［4－6］，而这些药理活性正好逐一针对着 IBS的内脏高敏性、炎症、神经免疫机制和肠道菌群失调等各种发病机制。因此我们初步推测落新妇苷可能为菝葜提取物中治疗C-IBS的单体成分之一。

Fig 5 Graph of high performance liquid chromatography(HPLC)of elution fraction group which is separated by different macroporous resin exchanger purification method from total extract of Smilax China L

C-IBS是一种较常见的消化系统疾病，其发病机制尚不十分明确。越来越多的研究表明，C-IBS的发生可能与神经递质、胃肠激素、免疫及神经系统的平衡性失调有关。其中5-HT、SP、SS、MC可能参与到了IBS整个病理生理过程，可能相互作用、相互影响。5-HT作为一种广泛存在的神经递质，胃肠道中的5-HT可以影响胃酸分泌及胃肠肌电活动［7］。许多研究已经证实5-HT信号系统发生异常可导致胃肠道动力及分泌功能异常，内脏敏感性异常，与IBS的发病密切相关［8］。SP不仅是一种重要的神经递质，而且还是神经系统、内分泌系统和免疫系统共同的化学语言，是传递信息、调节机体反应的重要信使［9］。SP 能引起整个胃肠道平滑肌的收缩［10］。SS是一种新提纯的下丘脑多肽激素，因为其对生长激素(GH)的分泌抑制故而得名，在人体内分布广泛，血循环中的SS可能主要来自于胃肠道［11］。当胃肠道中SS的含量高于正常水平时，则会使肠蠕动变缓。MC在胃肠道含量丰富，通过释放如5-HT、NO、VIP等多种生物活性物质来影响调节胃肠运动［12］。而来自肠分泌细胞的SS、SP等物质也可以通过神经分泌和旁分泌来调节MC的功能［13－14］。

本实验研究发现，菝葜提取物低剂量组可以降低模型组大鼠血清5-HT含量，降低血浆SS含量，升高血浆SP含量，可以减少模型组大鼠结肠MC计数，降低结肠5-HT、SS、SP、脊髓SP免疫组化染色强度的表达，说明该药对C-IBS大鼠有一定的干预作用，其作用机制可能是通过调整模型大鼠血清5-HT，血浆 SS、SP，结肠 5-HT、SP、SS、MC，脊髓 SP 等来实现的。

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