提高水牛奶中共轭亚油酸含量的菌种筛选

黄艳，卢安根，杨益林，莫建光

（广西分析测试研究中心，广西 南宁 530022）

提高水牛奶中共轭亚油酸含量的菌种筛选

黄艳，卢安根，杨益林，莫建光

（广西分析测试研究中心，广西 南宁 530022）

在水牛奶中分别添加不同的菌种进行发酵，通过溶剂法提取发酵乳中的脂肪，采用BF3/甲醇对脂肪酸进行甲酯化，使用紫外分光光度法与气相色谱法相结合进行发酵乳中共轭亚油酸的含量测定。结果显示，经单一菌种发酵的水牛奶其共轭亚油酸（CLA）的含量均有一定的提高，其中德式乳杆菌保加利亚亚种的转换能力相对最高。

水牛奶；共轭亚油酸；紫外分光光度；气相色谱

共轭亚油酸（Conjugated Linoleic Acid，CLA）是近20年来人类发现的最重要的功能性脂肪酸，作为一种类脂功能性因子，CLA具有抑制癌症和肿瘤的形成、减肥、抗动脉粥样硬化、改善免疫功能、降低胆固醇、促进生长、促进骨组织代谢、预防糖尿病的发生等多种生物活性[1]。

水牛奶是地方特色产品，在中国，只有广东、江西、广西等5个省有水牛。广东人熟悉的姜撞奶、双皮奶等，都必须用水牛奶来制作。水牛奶营养价值高，乳脂率含量为7.9%，而普通牛奶一般是3%～3.5%。由于牛奶是人们补充营养物质较快的途径之一，所以提高水牛奶中CLA的含量，让人们更好地获取CLA具有重要意义[2]。

为了增加牛奶中CLA的含量，以便从中获得更多的CLA，国内外研究人员对黑花牛奶CLA的形成机理进行了很多研究，表明牛奶的CLA含量与奶牛的饲料息息相关，增加油脂类饲料，可提高牛奶中CLA含量。但到目前为止国内外用发酵法提高水牛奶中CLA的研究报道较少。

研究利用紫外分光光度法结合气相色谱法快速准确检测发酵乳中CLA含量。水牛奶中添加不同微生物菌种进行发酵研究，提高水牛奶中的CLA含量，为开发功能性水牛奶制品提供技术参考。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、德式乳杆菌保加利亚亚种：广东省微生物菌种保藏中心提供。

水牛奶：广西农科院水牛奶。

1.1.2 培养基[3]

分离平板培养基：MRS。

保存培养基：MRS琼脂培养基；脱脂牛奶培养基。发酵培养基：水牛奶液态培养基。

1.1.3 实验仪器

UV1902双光束紫外分光光度计：美国热电；安捷伦6890N气相色谱仪：美国安捷伦。

1.1.4 试剂

共轭亚油酸的标准样品（高级纯）。

分析纯氨水、95%乙醇、无水乙醚、石油醚、BF3/甲醇、正己烷，氯化钠等。

1.2 方法

1.2.1 水牛奶中脂肪的提取

1.2.1.1 方法一

1.称取适量的水牛奶放入毛氏抽脂瓶中，加入2mL的25%的氨水，放入65℃水浴锅中水浴15 min，取出轻摇，冷却至室温；2.加入10 mL乙醇，加入25 mL乙醚，塞上塞子振摇1min。加入25mL石油醚，振摇1min。静止分层。有机层转入烧瓶中。反复提取3次。

1.2.1.2 方法二

将水牛奶在10℃以下、10000 r/min的条件下，离心30 min，取上层固体于50 mL试管中，加入18 mL的正己烷/异丙醇混合溶液，再加入2 mL的丙酮混匀，在溶液中加入硫酸钠，静置分离两相，分离上层有机相于烧瓶中。

1.2.1.3 方法三

称取适量水牛奶于离心管中，加入正己烷/异丙醇混合液4 mL漩涡振荡2 min，加入3 mL硫酸钠溶液，漩涡振荡2 min后，静置10 min～20 min。取上清液。

1.2.2 脂肪酸甲酯化

在提取得到的水牛奶脂肪中加入8 mL BF3/甲醇，65℃回流15 min，加入10 mL正己烷回流1 h，取出冷却至室温加入4 mL饱和食盐水，轻摇数次后，移入分液漏斗中，静置分层，将上层液体转移到烧瓶中。再用8 mL的正己烷萃取3次，合并萃取液，过无水Na2SO4以除去其中痕量的水，旋转蒸发后用正己烷定容到10 mL。所得液为待测液。

1.2.3 最大吸收波长扫描与标准曲线回归方程的建立[4-5]

用紫外分光光度仪对同一浓度的共轭亚油酸甲酯进行波长扫描，确定其最大吸收波长。

根据共轭亚油酸甲酯的最大吸收波长下其吸光度与浓度的关系，建立标准曲线及回归方程。准确量取0.1 mL的CLA标准样品，放入锥形瓶中甲酯化，定容到 10 mL，分别移取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、1.0 mL试液于10 mL容量瓶中，用紫外分光光度计测定其吸光度。

1.2.4 气相色谱测定条件[6]

色谱柱：DB-23，30 m×0.25 mm，0.25 μm；升温程序：初始温度140℃，以80℃/min升至250℃；进样器温度：250℃；检测器FID温度：300℃；载气：氮气；载气流速：1.0 mL/min。

1.2.5 水牛奶中菌种的发酵

1.2.5.1 菌种活化

用无菌水使冻干菌体溶解呈悬浮状，移植到牛奶培养基中37℃静置培养48 h，转接至MRS或者牛奶+MRS混合培养基上。挑一单菌落转接至MRS培养基中（或用牛奶+MRS混合培养基），进行分离纯化，确认无杂菌后镜检观察菌落形态是否与该菌的生理形态一致，最后放置4℃保藏。

1.2.5.2 水牛奶预处理

用巴氏消毒处理，将新鲜水牛奶分装到500 mL瓶子中，盖好盖子后放入65℃水浴锅中1 h。巴氏消毒后的水牛奶需做菌落总数平板计数验证。

1.2.5.3 发酵培养

不同菌种按2%菌液分别接种至50 mL已巴氏消毒的水牛奶中（37℃，pH 6.45）静置培养24 h。

实验均设3个平行样，取平均值。

2 结果与讨论

2.1 提取水牛奶脂肪的方法比较

提取水牛奶脂肪方法的比较，如表1所示。

表1 抽提水牛奶脂肪方法的比较Table 1 Compared the method with extraction of water milk's fat

经过几种提取水牛奶中脂肪的方法，由表1可知方法一提取脂肪效果较好，所以采用方法一来作为我们今后提取发酵乳中脂肪的方法。

2.2 共轭亚油酸甲酯的紫外吸收光谱扫描

共轭亚油酸甲酯的紫外吸收光谱扫描见图1。

图1 共轭亚油酸甲酯的紫外吸收光谱扫描Fig.1 Scan CLA of the wavelength of maximum

从图1中可以看出CLA甲酯的最大吸收波长为233 nm。

2.3 标准曲线及回归公式

利用紫外分光光度计测定标准曲线见图2。

图2 共轭亚油酸甲酯的工作曲线及回归方程Fig.2 Standard curve of CLA

回归公式为：y=7.45x+0.0282（R2=0.9992）。

牛奶中共轭亚油酸含量的计算公式：

式中：C为标准曲线得到CLA甲酯的浓度，（mg/g）；V1为样品稀释的体积，mL；V2为取样的体积，mL；M为水牛奶取样质量，g。

2.4 发酵乳CLA检测结果

1.发酵中未添加亚油酸底物，通过紫外分光光度法与气相色谱法测定发酵乳中CLA含量，2种方法进行对比，测结果相互吻合，确保筛菌过程中首先使用紫外分光光度法粗筛的准确性，见表2。

表2 发酵后水牛奶CLA含量测定（未添加底物LA）Table 2 The content of CLA in fermented milk（without Substrate LA） m g/100 g

如表2所示，我们发现4种菌种在一定程度上均提高了水牛奶中CLA的含量，其中德式乳杆菌保加利亚亚种的转化能力稍高。

2.发酵中添加亚油酸（1 mg/mL）底物，通过紫外分光光度法与气相色谱法测定发酵乳中CLA含量见表3。如表3所示，在发酵时添加与不添加亚油酸为底物，没有对发酵乳中CLA的含量有所改变。

3 结论

进入21世纪以来，人们越来越追求健康的生活，CLA的健康功效受到人们的关注，消费者对其需求越来越迫切。而CLA主要存在于反刍动物的乳脂和肉制品当中，水牛奶由于具有全面的营养，被认为是较好的共轭亚油酸食物来源，水牛奶中CLA的定量分析是确定牛奶脂肪酸营养的一个重要依据，因此提高水牛奶中CLA的含量是我们努力的方向。

表3 发酵后水牛奶CLA含量测定（添加底物LA）Table 3 The content of CLA in fermented milk（with Substrate LA）m g/100 g

用微生物发酵法，利用整个细胞转化或酶催化转化，将亚油酸及其衍生物转化成CLA，可以克服化学转化法的缺点。而且生物法生成的异构体单一，反应条件温和，生成的CLA异构体单一的特点，逐渐受到人们的重视，已经发现一些瘤胃菌、丙酸菌和乳酸菌等具有将LA人转化为CLA的能力。这些微生物中含有亚油酸异构酶，其作用点是在脂肪酸C12双键上，能把亚油酸特异性转化为c9，t11-CLA[6-7]。我们在水牛奶中分别添加了保加利亚乳杆菌、德式乳杆菌保加利亚亚种、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌等4种微生物，发酵培养24 h，使用筛选效果良好的水牛奶脂肪提取方法提取发酵乳脂肪，进行甲酯化，通过紫外分光光度法与气相色谱法测定发酵乳中CLA含量，发现4种菌种在一定程度上均提高了水牛奶中CLA的含量，其中德式乳杆菌保加利亚亚种的转化能力稍高。

实验表结果表明，在发酵时添加与不添加亚油酸为底物，没有对发酵乳中CLA的含量有所改变。本次实验添加的LA浓度为1.0 mg/mL，可能是因为处于对数生长期的菌种对底物较为敏感，菌种的生长处于抑制状态，但添加亚油酸底物是否有利于发酵水牛奶提高CLA含量还需要更多的实验证实。

[1]张英锋,李长江,包富山.共轭亚油酸的结构、生理功能及来源[J].化学教育,2005(10):6-8

[2]Petersen B L.Influence of Capsularccharide-producing streptococcus Mozzarella cheese and cheese whey[J].Journal dairy science,2000,83(12):1952-1956

[3]高翔,郑裴,马海乔,等.乳酸菌固态发酵生产CLA功能性豆粕的研究[J].安徽农学通报,2008,14(8):90-92

[4]张亚刚,樊莉,文彬,等.紫外可见分光光度法在共轭亚油酸定量分析中的应用[J].新疆石油学院学报,2002,6(2):59-63

[5]周凌华,张灏,郑小平,等.共轭亚油酸紫外检测方法的研究[J].乳业科学与技术,2007,5(126):267-270

[6]PARIZA M W,YANG X Y.Method of producing conjugated fatty acid:US:6060304[P].2000-05-09

[7]王中太,曹健,尹艳丽,等.共轭亚油酸的生物合成及相关酶基因的克隆与表达[J].化学与生物工程,2008,25(4):7-10

Increase the Conjugated Linoleic Acid Content of Water Milk by Fermentation

HUANG Yan,LU An-gen,YANG Yi-lin,MO Jian-guang
（Guangxi Center of Analysis and Test Research,Nanning 530022,Guangxi,China）

Adding different microbial strain to ferment water milk,applying solvent method to extracted CLA and than using BF3/Methanol for fatty acid methyl,to determine the CLA contents by UV Spectrophotometry and GC,and the results showed that,after screening of bacteria and fermenting,water milk's CLA content was increased,German lactobacillus subsp bulgaricus's conversion capability was better.

water milk;Conjugated linoleic acid;UV Spectrophotometry;GC

广西壮族自治区直属公益性科研院所基本科研业务费专项课题（2009ACZ11）

黄艳（1982—），女（汉），工程师，硕士，长期从事食品营养物质的检测工作。

2011-12-19