高效液相色谱法检测富硒酵母中的硒代蛋氨酸

韦淑毅，钟其顶，高红波，邢江涛，王道兵，熊正河，*，王岁楼

（1.中国药科大学，江苏 南京 210009；2.中国食品发酵工业研究院，北京 100027）

高效液相色谱法检测富硒酵母中的硒代蛋氨酸

韦淑毅1，2，钟其顶2，高红波2，邢江涛2，王道兵2，熊正河2，*，王岁楼1，*

（1.中国药科大学，江苏 南京 210009；2.中国食品发酵工业研究院，北京 100027）

建立了高效液相色谱法测定富硒酵母中硒代蛋氨酸的分析方法。采用酶解提取法提取富硒酵母样品中的硒代蛋氨酸，丹磺酰氯柱前衍生，C18色谱柱（4.6 mm×250 mm i.d.,5 μm）分离，以10 mmol/L磷酸二氢钠缓冲液（含4%N，N-二甲基甲酰胺，pH=6.55）和乙腈为流动相进行梯度洗脱，荧光检测（激发波长：320 nm；发射波长：523nm）。硒代蛋氨酸的检出限为（S/N=3）1 μg/L，定量限为（S/N=10）5 μg/L。在 1 mg/L～50 mg/L 范围内的线性关系良好（R≥0.9996）。加标回收率在91.12%～107.83%，方法相对标准偏差＜1.2%。本方法具有专属性好，灵敏度高，适用于富硒酵母原料及相关产品中的硒代蛋氨酸的定量测定。

富硒酵母；硒代蛋氨酸；丹磺酰氯；高效液相色谱法

硒（Selenium，Se）是人体必需微量元素，存在于抗氧化酶和甲状腺素代谢酶的活性中心[1-2]，缺硒导致克山病，合理补硒可有效减少人类及动物罹患癌症的风险[3]。蛋氨酸中硫被硒取代后得到硒代蛋氨酸（Selenomethionine，SeMet），是生物利用度最高的有机硒化物[4]，人体吸收后可在体内形成硒储备池[5]。富硒酵母是被广泛研究的食品硒补充剂[6]，在培养基中加入无机硒，利用酵母将难吸收的无机硒源转化为易吸收的有机硒源[7]。Clark等[8]的临床研究证明将富硒酵母纳入饮食中作为硒补充剂可减少大约50%的癌症发病率与死亡率。作为硒代蛋氨酸的最经济来源，富硒酵母中总硒的70%～76%以硒代蛋氨酸的形式存在[9-10]，富硒酵母中硒代蛋氨酸的含量对评价其质量与营养价值具有重要意义。

目前，国外测定富硒酵母中硒代蛋氨酸的方法有高效液相色谱串联电感耦合等离子体质谱法（HPLC-ICP-MS），高效液相色谱串联质谱法（HPLC－MS），毛细管电泳-电化学发光法（CE-ECL）等，国内相关文献较少。Chassaigne等[11]采用稀酸提取，HPLC-ICP-MS进行富硒酵母中有机硒检测；Po覥atajko等[12]采用水溶液超声提取，HPLC-MS检测富硒酵母中硒代蛋氨酸；以上方法采用色谱-质谱联用仪器昂贵，使其应用受到一定限制。Deng等[13]采用稀酸提取，CE-ECL检测富硒酵母中硒代蛋氨酸；但电泳方法的重现性不高。考虑到以上方法的不足以及现实生产应用中对检测方法的要求——需兼顾准确性与经济性，本实验针对富硒酵母中硒代蛋氨酸进行分析，采用酶解法进行样品提取，通过对样品的色谱分离及衍生等条件进行研究，建立了丹磺酰氯（DNS-Cl）柱前衍生高效液相色谱—荧光法测定富硒酵母中硒代蛋氨酸。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

富硒酵母原料（硒含量2000 μg/g）：安琪酵母有限公司；硒代蛋氨酸（≥98%）：J&K，SCIENTIFIC LTD；丹磺酰氯（≥98%）：ACR譫S ORGANICS；蛋白酶 XIV：Sigma：乙腈（色谱级）：Fisher Scientific；盐酸（优级纯）、无水碳酸钠（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）均为北京化工厂生产；甲胺盐酸盐（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；N，N-二甲基甲酰胺（分析纯）：西陇化工股份有限公司；磷酸二氢钠（分析纯）：上海试剂总厂；实验用水为Milli-Q水。

1.2 仪器与设备

Waters 2695高效液相色谱仪配荧光检测器：美国Waters公司；WH-861型旋涡混合振荡器：太仓市科教仪器厂；pHS-3C型酸度计：上海雷磁仪器厂；THERM Ostar-95型数显恒温水浴锅：浙江省轻工业研究所；HC-3518型高速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；THZ-Q型台式冷冻恒温振荡器：太仓市华美生化仪器厂；AB204-N型万分之一分析天平：MettlerToledo。

1.3 测定方法

1.3.1 标准储备溶液的配制

称取适量硒代蛋氨酸标准品，用Milli-Q水制成1.0 mg/L的硒代蛋氨酸标准储备液。称取适量17种常见氨基酸，用0.1 mol/L盐酸配成1.0 mg/L的氨基酸混标溶液，以上溶液均置4℃冰箱冷冻保藏[14]。

1.3.2 样品前处理条件

1.3.2.1 样品提取

称取0.1 g经冷冻研磨的富硒酵母原料（或0.5 g富硒酵母产品），置于10mL离心管中，加入5mL0.05mol/L磷酸氢钠缓冲液（pH=7.4），40 mg蛋白酶XIV，充分混匀后于37℃摇床振摇24 h。振摇结束后向样品酶解液中加入0.1 mL 1.5 g/L亚铁氰化钾溶液及0.1 mL 3 g/L乙酸锌溶液，充分混匀后在3000 r/min下离心10 min，取上清液待测，用80 mmol/L碳酸钠缓冲液（用1 mol/L HCl调节pH至9.5）适当稀释，使样品含量在方法线性范围内。

1.3.2.2 样品衍生

取1 mL稀释后的酶解液于5 mL离心管中，加入1 mL 80 mmol/L碳酸钠缓冲液（pH=9.5），1 mL丹磺酰氯（6.0 mg/L，乙腈介质），涡旋混匀，于60℃水浴避光衍生2 h，加入0.1 mL 20 mg/mL盐酸甲胺溶液终止衍生反应。避光放置15 min，0.22 μm有机微孔滤膜过滤上机检测。

取1 mL系列不同浓度的硒代蛋氨酸标准工作液，按照如上方法进行衍生。

1.3.3 色谱条件

Pursuit XRs C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm)；荧光检测器：激发光波长：320 nm，发射波长：523 nm；柱温30℃；进样量为10 μL；流动相为乙腈-10 mmol/L磷酸二氢钠缓冲液（含4%N，N-二甲基甲酰胺pH=6.55）[15]；流速为 1.0 mL/min，梯度洗脱程序：（T，乙腈%）0 min，14%；5 min，20%；10 min，25%；12 min，25.6%；15 min，25.7%；19 min，25.9%；23 min，26.5%；30 min，27%；34 min，30%；38 min，43%；41 min，68%；45 min，68%；47 min，86%；52 min，86%。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的优化

2.1.1 硒代蛋氨酸提取方法的选择

酵母细胞壁主要由β-葡聚糖、甘露聚糖、糖蛋白以及丁几质构成，比较了超声水溶液提取法与酶解提取法的提取效率,前者按Casiot等[16]所述操作，后者按1.3.2节所述操作。结果显示，酶解提取液中硒代蛋氨酸浓度为水溶液提取液的30倍，说明富硒酵母中硒代蛋氨酸主要以蛋白结合形态存在，因此本试验采用酶解提取法提取游离态及结合态的硒代蛋氨酸。

2.1.2 蛋白酶XIV用量选择

平行取5份0.1 g富硒酵母原料样品，分别加入5、10、20、40、60 mg 蛋白酶 XIV，按照实验方法酶解测定，酶量在5 mg～40 mg时硒代蛋氨酸的面积随酶量增加而增大，在40 mg～60 mg时硒代蛋氨酸的面积变化较小，说明40 mg蛋白酶XIV已经将结合态的硒代蛋氨酸完全释放出来，结果如图1，因此本试验采用蛋白酶XIV的用量为40 mg。

图1 不同蛋白酶XIV使用量对酶解效率的影响Fig.1 Effect of different protease XIV usages on enzymatic efficiency

2.1.3 衍生条件的优化

在25℃的碳酸钠缓冲体系中，丹磺酰氯与一级、二级甚至三级氨基官能团进行荧光标记，灵敏度达1 μg/L[17]，反应 pH、衍生剂浓度、衍生温度与时间都对衍生反应产率有一定的影响[18]。相关文献[15，19-21]提及，当反应缓冲体系pH为9.5时，衍生效果最好；在前人研究的基础上，本试验采用80 mmol/L（pH 9.5）碳酸钠缓冲液为衍生反应溶液，衍生温度为60℃，重点对衍生剂浓度与衍生时间进行了优化。

以富硒酵母原料为待测样品，综合考察在不同衍生剂浓度及衍生时间下加标回收率的水平，结果如表1所示，当丹磺酰氯浓度为6.0 mg/L，衍生时间为2 h时，回收率较理想。

2.2 色谱条件的优化

富硒酵母基质中含有多种氨基酸对硒代蛋氨酸的测定产生一定的干扰，试验采用10 mmol/L磷酸氢钠缓冲液（含 4%N，N-二甲基二甲胺，pH 6.55）-乙腈为流动相[15]，依据的酵母基质特性对梯度洗脱的方法进行了优化，最终在1.3.3色谱条件下，酵母中常见的17种氨基酸与硒代蛋氨酸获得了良好分离，图2为17种常见氨基酸与硒代蛋氨酸衍生物的色谱图,图3为酵母样品衍生的色谱图。

表1 不同衍生试剂浓度与衍生时间下所得的加标回收率Table 1 The recovery of spiked sample extract with different DNS-Cl concentrations and derivative time

图2 17种常见氨基酸与硒代蛋氨酸混标衍生物的液相色谱图Fig.2 Chromatogram of the standards of 17 common amino acids and selenomethionine

图3 富硒酵母样品衍生的色谱图Fig.3 Chromatogram of selenium-enriched yeast

2.3 方法的线性范围与检出限、定量限

取硒代蛋氨酸储备溶液逐级稀释成1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 mg/L的系列标准工作液，按试验方法衍生后测定，以峰面积y为纵坐标，质量浓度x（mg/L）为横坐标绘制标准工作曲线。结果表明：在1.0 mg/L～50.0 mg/L时，硒代蛋氨酸质量浓度与峰面积有良好的线性关系（r=0.9996），回归方程 y=122459x-48813，检出限（以S/N=3计）为1 μg/L，定量限（以S/N=10计）为 5 μg/L。

2.4 方法的重复性

取同一份富硒酵母样品6份，按照上述方法测定硒代蛋氨酸含量，方法的相对标准偏差小于1.2%，表明该方法具有良好的重复性。

2.5 加标回收率实验

取富硒酵母样品4份，加入不同量硒代蛋氨酸标准液，按照试验方法测定，计算加标回收率。由表2可见，硒代蛋氨酸的加标回收率在91.12%～107.83%之间。

表2 硒代蛋氨酸加标回收率实验Table 2 Recovery results of standard addition of selenomethionine in yeast enzymatic extrat

2.6 富硒酵母样品中硒代蛋氨酸的测定

根据建立的方法对5种不同富硒酵母样品及普通酵母进行检测，结果见表3。

表3 富硒酵母原料及产品中硒代蛋氨酸的测定结果Table 3 The detection results of selenomethionine in seleniumenriched yeasts materials and related products

3 结论

本文建立了丹磺酰氯柱前衍生-高效液相色谱法检测富硒酵母中硒代蛋氨酸的分析方法。重点对样品提取方法和衍生方法进行了研究。1）样品提取方法研究：对酶解提取和超声提取富硒酵母中硒代蛋氨酸方法进行比较，结果表明酶解法测定结果远大于超声水溶液提取法，并对酶用量进行优化，有效提高了富硒酵母中硒代蛋氨酸的提取效率。2）硒代蛋氨酸衍生及分离条件研究：选择丹磺酰氯进行柱前衍生，并对衍生剂浓度及衍生时间进行了优化，采用磷酸二氢钠缓冲液和乙腈进行梯度洗脱，硒代蛋氨酸与富硒酵母中常见氨基酸及其它基质干扰组分得到有效的分离；方法加标回收率在91.12%～107.83%之间，相对标准偏差＜1.2%。该方法相对于液相色谱-ICP质谱法，普及性强，操作简单，兼顾准确性和经济性等特点，适合运用于实际生产对富硒酵母中硒代蛋氨酸进行定量分析。

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Determination of Selenomethionine in Selenium-enriched Yeast by Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography

WEI Shu-yi1,2,ZHONG Qi-ding2,GAO Hong-bo2,XING Jiang-tao2,WANG Dao-bing2,XIONG Zheng-he2,*,WANG Sui-lou1,*
（1.China Pharmacutical University,Nanjing 210009,Jiangsu,China;2.National Research Institute of Food&Fermentation Industries,Beijing 100027,China）

The high performance liquid chromatography detection methods for selenomethionine in seleniumenriched yeast is established,which utilizes protein enzymes for selenomethionine extraction,dansyl chloride for derivatizaiton,C18reverse column(4.6 mm×250 mm i.d.,5 μm)for seperation,10 mmol/L phosphate buffer solution and acetonitrile for gradient elution,fluorescent detector(λex:320 nm;λem:523 nm)for determination.The detection limit(S/N=3)is 1 μg/L,and quantification limit(S/N=10)is 5 μg/L.Detection of 1 to 50 mg/L selenomethionine produces a linear response(R≥0.9996)and the recovery is quantitative around 91.12%-107.83%,the RSD<1.2%.The present methods is speficitive,sensitive,economatic and accurate,and be used in the determination of selenomethionine for the selenium-enriched yeasts materials and relating products.

selenomethionine;selenium-enriched yeast;dansyl chloride;hige performance liquid chromatography

韦淑毅（1986—），女（壮），硕士研究生，主要从事富硒酵母中活性成分的检测技术研究。

*通信作者1：熊正河（1957—），女，教授级高工，研究方向：发酵类食品标准的研究与制定。

*通信作者2：王岁楼（1961—），男，教授，博士生导师，工学博士，药物分析学科食品质量与安全方向。

2012-03-13