厄贝沙坦片的人体生物等效性研究

程春燕，李 珍＊，张逸凡，李松华

（1.第二军医大学长海医院药学部，上海200433；2.中国科学院上海生命科学院药物研究所药物代谢研究中心，上海201203；3.第二军医大学长海医院心血管内科，上海200433）

［本文编辑］阳凌燕

厄贝沙坦（irbesartan）是一种口服血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，在高血压、充血性心力衰竭等的治疗中发挥着重要作用，有降压作用显著、药物不良反应小，口服吸收良好等优点［1，2］。本研究采用 LC－MS／MS法［3］测定24例健康受试者口服厄贝沙坦片（受试制剂）和原研厂生产的厄贝沙坦片（参比制剂）的血药浓度，求算药动学参数和相对生物利用度，并进行生物等效性评价，为临床合理用药提供依据。

1 受试对象和试药

1.1 受试对象 24例男性健康受试者，年龄（20.6±1.0）岁，体 重（66.42±5.59）kg，身 高（172.79±4.88）cm，体重指数（22.22±1.18）kg／m2，试验前体格检查和实验室检查均未见异常，无药物与食物过敏史，无烟、酒嗜好及滥用毒品史，筛选前2周内未服用过可能影响本研究结果的药物，入选前3个月内未参加过其他药物临床试验且无献血史。试验方案经第二军医大学长海医院伦理委员会批准后实施。所有受试者均签署知情同意书。

1.2 药品和试剂 受试制剂：厄贝沙坦片（江苏恒瑞医药股份有限公司，0.15g／片，批号080306518）；参比制剂：厄贝沙坦片（商品名 安博维，杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司，0.15g／片，批号1805）。厄贝沙坦对照品（中国食品药品检定研究院，批号100607－200301，纯度99.9%）；氯沙坦钾对照品（深圳倍素特公司，批号1370462，纯度99.9%）；甲醇和乙腈为色谱纯（美国Sigma公司）；醋酸铵和甲酸为色谱纯（美国Tedia公司）；水由法国Millipore公司纯水机制备。

2 方法和结果

2.1 试验设计和血样采集 24例男性健康受试者随机分成2组，每组12人。受试者禁食至少10h，次日晨空腹用200ml温开水送服0.15g片剂，一组服用受试制剂，另一组服用参比制剂。受试者服药后2h内禁水，4h后给予统一标准餐。7d的清洗期后，两组受试者交叉服用药物，于服药前和服药后0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、16、24、36h 于肘静脉采血2ml，肝素抗凝，9×102×g离心10min，分取血浆于－20℃冰箱保存。

2.2 血药浓度测定方法

2.2.1 仪器 Agilent 1100液相色谱系统（包括G1311A型四元输液泵、G1367A型自动进样器、G1316A型柱温箱和G1322A型脱气机，美国Agilent公司）；TSQ Quantum Ultra型三重四极杆串联质谱仪，配备电喷雾电离源（ESI源），数据采集使用Xcalibur 2.0.7软件（美国 Thermo Finnigan公司）。

2.2.2 色谱条件和质谱条件 色谱柱为Zorbax SB C18柱（150mm×4.6mm，5μm，美国 Agilent公司）；C18保护柱（3.0mm×4.0mm，5μm，美国Phenomenex公司）；流动相为乙腈－水－甲酸（90∶10∶0.25）；流速为0.5ml／min，柱温为20℃。离子源为电喷雾电离源，源喷射电压4.0kV，加热毛细管温度为320℃，鞘气（N2）压力为0.6MPa，辅助气（N2）流 量 4.8L／min，碰撞气（Ar）压 力0.16Pa。厄贝沙坦和内标氯沙坦钾的碰撞诱导解离（CID）电压分别为20和45eV，正离子方式检测，扫描方式为选择反应监测（SMR）。用于定量分析的离子反应分别为厄贝沙坦m／z429→207和氯沙坦m／z423→207，扫描时间为0.3s。

2.2.3 标准溶液配制 精密称取厄贝沙坦对照品适量，用甲醇溶解并配成浓度为1.00mg／ml的厄贝沙坦储备液Ⅰ。取200μl储备液Ⅰ，用甲醇∶水（50∶50）稀释至 1.00ml，得厄贝沙坦浓度为200μg／ml的储备液Ⅱ，再以甲醇∶水（50∶50）稀释得 浓 度 依 次 为 8、4、1.6、0.4、0.16、0.04、0.012μg／ml的厄贝沙坦系列标准溶液。同法制备浓度为6.4、0.4、0.03μg／ml的质控样品。以甲醇溶解并稀释，制得浓度为1μg／ml的氯沙坦钾内标溶液。各储备液、系列标准溶液、质控溶液及内标溶液均以相应体积，经校正的移液器和容量瓶配制，并在4℃冰箱内保存备用。

2.2.4 血浆样品的预处理 向100μl血浆中分别加入50%甲醇溶液50.0μl，内标溶液25.0μl（1μg／ml氯沙坦溶液）和200μl乙腈，涡旋混匀，8.6×103×g离心5min。取100μl上清液于40℃空气流下吹干。残留物溶于200μl流动相中，取10 μl进行LC－MS／MS分析。

2.2.5 标准曲线及最低定量浓度的确定 取空白血浆100μl，配制成相当于厄贝沙坦血浆浓度为0.006、0.02、0.08、0.2、0.8、2.0和4.0μg／ml的样品，按2.2.4项下操作，每一浓度进行双样本分析，进样10μl，记录色谱图。以待测物浓度为横坐标（X），待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标（Y），用加权最小二乘法进行回归运算，加权系数W＝1／x2。回归方程为Y＝1.72×10－2X＋4.37×10－3，r＝0.999 6，厄贝沙坦的线性范围为 0.006～4.0μg／ml，最低定量浓度为0.006μg／ml。

2.2.6 回收率和精密度实验 取空白血浆100μl，按2.2.3项下方法制备低、中、高3个浓度（厄贝沙坦片血浆浓度分别为0.015、0.2和3.2μg／ml）的质控样品，每一浓度进行6样本分析，连续测定3d，根据当日的标准曲线，计算质控样品的测得浓度。同时另取空白血浆100μl，除不加系列标准溶液和内标溶液外，向上清液中分别加入低、中、高3个浓度的质控溶液50μl和内标溶液25μl，涡旋混合，按2.2.4项下操作，取10μl进行LC－MS／MS分析，得相应峰面积。以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算方法回收率，分别为（92.2±3.5）%、（98.6±4.1）%和（93.8±4.9）%；根据质控样品结果计算得厄贝沙坦每一浓度水平的质控样品日内RSD均＜4.5%，日间RSD均＜11.0%。

2.2.7 稳定性实验 血浆样品室温放置2h后，经沉淀蛋白质处理后在室温放置24h、经历3次冷冻－解冻循环、－20℃放置30d后稳定，厄贝沙坦储备液于4℃放置30d后稳定。

2.2.8 基质效应 厄贝沙坦低、高浓度基质效应分别为106%和110%，且RSD均＜3.1%；内标基质效应为109%，RSD为5.2%。结果表明，在本研究选择的色谱和质谱条件下，可忽略基质效应的影响。

2.3 药动学参数和相对生物利用度 本研究所测得的血药浓度数据用非房室模型进行计算，cmax和tmax用实测值表示，AUC0～t用梯形法计算，AUC0～∞＝AUC0～t＋ctn／λz，tn是最后一次可实测浓度的取样时间；ctn是末次可测定样本药物浓度；λz是对数血药浓度－时间曲线末端直线部分求得的末端消除速率常数，可用对数血药浓度－时间曲线末端直线部分的斜率求得；t1／2用公式t1／2＝0.693／λz计算。根据公式F＝AUCT／AUCR×100%计算受试制剂的相对生物利用度，结果见表1。受试制剂和参比制剂的平均血药浓度－时间曲线见图1。

表1 健康受试者单剂量口服0.15g厄贝沙坦后的主要药动学参数Table 1 Main pharmacokinetic parameters after a single oral dose of 0.15g test and reference irbesartan tablets in healthy volunteers（n＝24，）

表1 健康受试者单剂量口服0.15g厄贝沙坦后的主要药动学参数Table 1 Main pharmacokinetic parameters after a single oral dose of 0.15g test and reference irbesartan tablets in healthy volunteers（n＝24，）

组别 cmax（ρB／μg·ml－1） tmax（t／h） t1／2（t／h） AUC0～t（A／μg·h·ml－1）AUC0～∞（A／μg·h·ml－1） F（%）受试制剂 1.89±0.54 1.63±0.92 10.9±6.1 9.58±2.56 10.23±2.98 110.5±21.6参比制剂 1.99±0.46 1.52±0.83 11.4±7.7 8.90±2.87 9.56±2.93 100

图1 健康受试者单剂量口服0.15g厄贝沙坦片后厄贝沙坦的平均血药浓度－时间曲线Figure 1 Mean plasma concentration－time curves of irbesartan after a single oral dose of 0.15g irbesartan tablet in healthy volunteers

2.4 生物等效性评价 将受试制剂与参比制剂的AUC0～t和cmax经对数转换后用方差分析、双单侧t检验和90%置信区间法判断。结果AUC0～t和cmax均拒绝生物不等效假设，受试制剂AUC0～t的90%置信区间为参比制剂相应参数的102.4%～115.0%，cmax的90%置信区间为参比制剂相应参数的86.3%～103.2%，tmax无显著性差异（P＞0.05）。2.5 临床观察 单次口服0.15g受试制剂和参比制剂后，24例受试者均顺利完成两周期试验。3例因血压下降引起短时间的头晕、头痛，1例咳嗽，程度均为轻度，经研究者判定与试验药物可能相关，未经处置，均自行恢复，无严重不良事件发生。

3 讨 论

本研究采用LC－MS／MS法测定健康人血浆中的厄贝沙坦浓度［3］，因乙腈质谱响应高于甲醇，故选择乙腈为流动相，同时加入少量甲酸（乙腈∶水∶甲酸为90∶10∶0.25）来提高待测物的离子化效率，避免了由于沉淀蛋白质带来的离子抑制。本方法具有准确、选择性强、灵敏度高的特点，适合于厄贝沙坦片的人体药动学和生物等效性研究。

所有受试者在给药前后进行的各项检查数据均正常或异常无临床意义，说明单次给予试验药物厄贝沙坦片安全性和耐受性良好。本研究所得厄贝沙坦的药动学参数与文献报道［4，5］基本一致。方差分析、双单侧t检验和90%置信区间分析结果表明，厄贝沙坦片受试制剂与参比制剂具有生物等效性。

［1］张改芝，王展辉.厄贝沙坦片治疗轻中度原发性高血压疗效观察［J］.第四军医大学学报，2009，30（18）：1774.Zhang GaiZhi，Wang ZhanHui.Observation of efficacy of irbesartan in treatment of mild to moderate essential hypertension［J］.J Fourth Mil Med Univ，2009，30（18）：1774.Chinese.

［2］周维光，丁继军，王 华，等.厄贝沙坦片治疗充血性心力衰竭92例临床疗效观察［J］.临床和实验医学杂志，2009，8（2）：17－19.Zhou WeiGuang，Ding JiJun，Wang Hua，etal.Effectiveness of irbesartan in patients with congestive heart failure：92cases’report［J］.J Clin Exp Med，2009，8（2）：17－19.Chinese with abstract in English.

［3］关 心，陈笑艳，宋 波，等.液相色谱－串联质谱法测定人血浆中厄贝沙坦［J］.中国药学杂志，2007，42（19）：1486－1489.Guan Xin，Chen XiaoYan，Song Bo，etal.Determination of irbesartan in human plasma by liquid chromatography－tandem mass spectrometry［J］.Chin Pharm J，2007，42（19）：1486－1489.Chinese with abstract in English.

［4］李雪宁，陈伟力，徐红蓉，等.伊贝沙坦片在中国健康受试者体内的生物等效性［J］.中国临床药学杂志，2003，12（4）：207－210.

Li XueNing，Chen WeiLi，Xu HongRong，etal.Bioequivalence of irbesartan in healthy Chinese volunteers［J］.Chin J Clin Pharm，2003，12（4）：207－210.Chinese with abstract in English.

［5］廉建伟，邓新秀，王志伟，等.复方厄贝沙坦片在健康志愿者体内的生物等效性［J］.中国临床药学杂志，2008，17（2）：105－108.Lian JianWei，Deng XinXiu，Wang ZhiWei，etal.Bioequivalence study of compound irbesartan dispersible tablets［J］.Chin J Clin Pharm，2008，17（2）：105－108.Chinese with abstract in English.