用RP－HPLC法测定盐酸林可霉素眼用温敏凝胶中盐酸林可霉素的含量

施启红（江苏省启东市人民医院药剂科，启东226200）

［本文编辑］兰 芬

目前市售的盐酸林可霉素制剂有片剂、胶囊剂和注射剂，其眼用制剂只有盐酸林可霉素滴眼液。滴眼液在滴入眼后与角膜接触的时间通常是1～2min，眼部生物利用度＜10%，需频繁给药，给病人带来不便。温敏凝胶是一种环境敏感型智能凝胶，在室温下为液体，在体温下转变为凝胶［1，2］。盐酸林可霉素眼用温敏凝胶为江苏省启东市人民医院的自制制剂，具有促进药物透皮吸收，延长药物作用时间等优点［3］，其主要成分为盐酸林可霉素。测定盐酸林可霉素含量最常用的方法是 HPLC法［4，5］，除此以外，还有分光光度法和微生物测定法等。《中华人民共和国药典》2010版收载了盐酸林可霉素片剂、注射液和胶囊，以及它们的质量控制方法，其他剂型尚未收载。本研究采用RP－HPLC法测定了盐酸林可霉素眼用温敏凝胶中盐酸林可霉素的含量，可为其质量控制提供方法。

1 仪器和试剂

1.1 仪器LC－10AVP型HPLC仪，包括LC－10ATVP泵、SPD－10AVP紫外检测器、Class VP色谱工作站和SCL－10AVP系统控制器（日本岛津制作所）；Diamond C18色谱柱（美国迪马公司）；DF－101S集热式恒温加热磁力搅拌器（河南省巩义市英峪予华仪器厂）；DL－720A超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）；TGL－16B台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；FA－2004电子天平（上海天平仪器厂）；精密酸度计（上海天达仪器有限公司）。

1.2 试剂和药品 盐酸林可霉素对照品（纯度99.5%，中国药品生物制品检定所，批号10773－0144）；泊洛沙姆407和泊洛沙姆188（美国BASF公司）；甲醇（色谱纯，美国Tedia公司）；其他试剂均为分析纯。盐酸林可霉素眼用温敏凝胶（批号110311、110314、110317，含盐酸林可霉素0.1%）和重蒸水由江苏省启东市人民医院自制。

2 方法和结果

2.1 溶液的制备（1）对照品储备液：精密称取盐酸林可霉素对照品2mg，置于10ml容量瓶中，加甲醇适量溶解，并稀释至刻度，得到浓度为200μg／ml的对照品储备液，置于4℃冰箱中保存。（2）样品溶液：取盐酸林可霉素眼用温敏凝胶1g，加10ml甲醇溶解，超声30min，取该溶液1ml，置于10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。将溶液移至EP管中，1.677×104×g离心5min，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得样品溶液。（3）阴性对照溶液：制备不含盐酸林可霉素的空白凝胶，按样品溶液制备方法操作，即得阴性对照溶液。

2.2 色谱条件和系统适应性实验 色谱柱：Diamond C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：0.05mol／L硼砂溶液（用磷酸调节pH 至7.4）－甲醇（50∶50）；流速：1.0ml／min；检测波长：214nm；进样量：20μl；柱温为室温。用甲醇将对照品储备液稀释，得到浓度为16μg／ml的对照品溶液，将该溶液与样品溶液和阴性对照溶液分别进样测定，得到色谱图见图1。由图1可见，盐酸林可霉素出峰时间约为16.5min，温敏凝胶中其他成分对测定无干扰。

图1 盐酸林可霉素的HPLC谱图Figure 1 HPLC photograms of lincomycin hydrochloride

2.3 标准曲线的绘制 精密量取2.1项下的对照品储备液0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.4ml，分别置于10ml容量瓶中，用甲醇定容，得到系列浓度为2、4、8、16、24、32和48μg／ml的标准溶液。按2.2项下色谱条件进样，测定峰面积（A）。以A对浓度（c）作线性回归，得到标准曲线方程A＝9 471.6c－175.1（r＝0.999 9），表明盐酸林可霉素在2～48μg／ml范围内线性关系良好。

2.4 精密度实验（1）日内精密度：取2.3项下低、中、高浓度为2、8、32μg／ml的对照品溶液各20μl，按2.2项下色谱条件，重复进样3次，两次进样间隔3h，记录峰面积，计算得到低、中、高浓度的日内RSD分别为1.40%、0.17%和0.28%（n＝3）。（2）日间精密度：取低、中、高浓度为2、8、32μg／ml的对照品溶液，每天测定1次，连续3d，记录峰面积，计算得到低、中、高浓度盐酸林可霉素的日间RSD分别为1.77%、0.84%和1.74%（n＝3）。

2.5 稳定性实验 按2.1（2）项下的方法配制批号为110311的样品溶液，在配制后的0、2、4、6、8h分别测定峰面积，计算得到RSD＝1.36%，表明样品溶液在配制后8h内稳定［6］。

2.6 重复性实验 取盐酸林可霉素眼用温敏凝胶样品5份（批号110311），按2.1项下（2）制备样品溶液，按2.2项下色谱条件进样，测定峰面积，计算得RSD＝1.98%（n＝5），表明该方法重复性良好。

2.7 回收率实验 精密量取浓度分别为2、8、32μg／ml的盐酸林可霉素对照品溶液0.5ml，加入适量已知浓度为9.78μg／ml的盐酸林可霉素眼用温敏凝胶样品，以甲醇稀释，按2.1（2）项下样品溶液配制方法得到低、中、高浓度分别为11.608、17.584和41.501μg／ml的溶液，进样测定。计算得到低、中、高浓度盐酸林可霉素的回收率分别为（91.40±1.27）%、（97.55±0.93）%和（99.13±1.11）%（n＝3）。

2.8 样品含量测定 取批号为110311、110314、110317的盐酸林可霉素眼用温敏凝胶样品，按2.1（2）项方法制备样品溶液，按2.2项下色谱条件测定含量。盐酸林可霉素眼用温敏凝胶中盐酸林可霉素的标示量为0.1%，结果测得3个批号的样品中盐酸林可霉素的平均含量分别为标示量的（98.67±1.21）%、（99.90±0.44）% 和（99.28±1.17）%（n＝3），实际含量均在标示量的95%～105%范围内，符合含量测定要求。

3 讨 论

盐酸林可霉素在高于60℃条件下不稳定，因此本研究对盐酸林可霉素眼用温敏凝胶的提取采用超声提取后冷藏处理的方法。该方法既可以使盐酸林可霉素提取完全，又可避免温度过高对含量测定的影响，减少对色谱柱的污染。制备盐酸林可霉素眼用温敏凝胶要求pH值范围是5～9，HPLC法测定时流动相体系中各成分的比例会影响其pH值，从而改变色谱图峰形。因此，本研究在筛选流动相时参考文献［4，5，7］做了一定的调整，最终确定以0.05mol／L的硼砂溶液（用磷酸调节pH 至7.4）－甲醇（50∶50）作为流动相。在该流动相下，盐酸林可霉素出峰时间约为16.5min，与其他组分分离良好，峰形对称。

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