茶叶浸提液对肉制品中亚硝酸盐的清除效应

2012-12-03郝教敏梁海燕汪建国杨华马俪珍

食品研究与开发 2012年5期

郝教敏，梁海燕，汪建国，杨华，马俪珍

（1.山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷 030801；2.新乡医学院公共卫生学系,河南新乡 453003;3.天津农学院食品系，天津 300384）

亚硝酸盐因其在食品加工过程中的发色、增香、调味作用，以及对肉毒梭状芽胞杆菌的抑制作用，而成为肉类食品加工过程中允许限量使用的食品添加剂[1]。但肉制品中亚硝酸盐残留超过一定量，其亚硝酸根极易与肉制品中蛋白质分解产物胺类物质、或在人体胃肠酸性环境下蛋白质分解产物二级胺类发生反应生成亚硝胺[2]，从而危害人体健康。世界卫生组织规定亚硝酸钠/钾每日允许摄入量为≤0.2 mg/kg体重，我国食品添加剂使用卫生标准（GB 2760-2007）[3]规定：在肉类制品和肉类罐头中亚硝酸盐的最大使用量为0.15 g/kg，残留量以亚硝酸钠计，肉类罐头不得超过50 mg/kg，肉制品不得超过30 mg/kg。据资料表明[4-5]，上市的各类熟肉制品的合格率平均仅为60.4%～87.0%。如何减少肉制品中亚硝酸盐的残留量问题[6]，尤其添加天然无毒的物质清除亚硝酸盐[7]已成为当今一个热门研究课题。

我国食品添加剂产业结构中能替代亚硝酸盐的物质较少，尤其是天然无公害替代物，目前列入国标GB2760的仅有甘草抗氧化物、茶多酚、植酸和磷脂等少数替代物。研究表明，一些含有VC、多酚、黄酮类化合物、多糖等物质的果蔬有降低或消除肉制品中亚硝酸盐残留的功效[8-10]；在肉制品生产中添加茶多酚（TP）可降低亚硝酸盐用量而发色能力不变[11]；在pH3.37模拟胃液条件下，绿茶对NaNO2的消除率随茶相对剂量增加呈指数曲线上升[12]；各种茶叶均有抑制阻断亚硝酸盐致突变合成亚硝胺的作用[13]。本研究拟在探讨茶叶浸提液清除肉制品中亚硝酸盐的最佳条件，为安全肉制品生产提供科学的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 原料

新鲜茶叶（绿茶）、梅林牌午餐肉、双汇王中王火腿肠：购于山西省太谷县家家利超市。

1.1.2 试剂

30%乙酸、95%乙醇、0.4%对氨基苯磺酸溶液、0.2%盐酸萘乙二胺、6 mol/L盐酸溶液、0.5 mol/L氢氧化钠溶液、5μg/mL标准亚硝酸钠溶液、硫酸锌、氯化胺缓冲液均为分析纯配制。

1.1.3 设备

BS-224S电子天平：北京赛多利斯天平有限公司；HH-8恒温水浴锅：金坛市新航仪器厂；WFJ2100型可见光分光光度计：上海棱谱仪器仪表有限公司；CN61M/BY01-1.2自动数显平衡离心机：西化仪（北京）科技有限公司；pH211型精密酸度计：上海雷兹仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 茶叶浸提液的制备

溶剂提取法[14]。

新鲜绿茶叶→浸于95%乙醇→水浴浸提→纱布过滤→静置→离心30 min→取上清液备用

称取150 g新鲜茶叶浸于1500 mL 95%乙醇中，物料比 1∶10。

1.2.2 肉样品处理[15]

称取约20.00 g经粉碎混匀的午餐肉，置于烧杯中，加70 mL水和12 mL氢氧化钠溶液（0.5 mol/L），用玻璃棒混匀，用氢氧化钠调节样品的pH为8，定量转移至200 mL容量瓶中并加入10 mL硫酸锌溶液，轻摇混匀，如不产生白色沉淀，再补加2 mL～5 mL氢氧化钠，混匀。置于90℃水浴中加热10 min，使蛋白质沉淀完全，取出后冷却至室温，加水至刻度，混匀。放置0.5 h，撇去上层脂肪，用滤纸过滤，弃去初滤液20 mL，收集滤液备用。

1.2.3 试验设计

试验设茶叶浸提温度、浸提时间、茶叶浸提液用量、茶叶浸提液与亚硝酸盐反应液的pH和反应时间5个单因素试验。然后采用正交试验设计确定茶叶浸提液清除亚硝酸盐的最佳条件。

1.2.3.1 浸提温度的确定

取5份2 mL标准亚硝酸钠溶液，分别加入60、70、80、90、100℃水浴浸提40 min的茶叶浸提液25 mL，用乙酸调节反应液pH为5.0，反应20 min，测定清除率。

1.2.3.2 浸提时间的确定

取6份2mL标准亚硝酸钠溶液，分别加入90℃水浴浸提 10、20、30、40、50、60min 的茶叶浸提液 25mL，调pH为5.0，20 min后，测定清除率。

1.2.3.3 茶叶浸提液用量的确定

取5份2 mL标准亚硝酸钠溶液，分别加入90℃水浴浸提 40 min 的茶叶浸提液 4、6、8、10、12 mL，用乙酸调节pH 5.0，20 min后，测定清除率。

1.2.3.4 反应液pH的确定

取5份2 mL标准亚硝酸钠溶液，加入90℃水浴浸提40 min的茶叶浸提液10 mL，用乙酸调节反应液pH 为 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，20 min 后，测定清除率。

1.2.3.5 反应时间的确定

取6份2 mL标准亚硝酸钠溶液，加入90℃水浴浸提40 min的茶叶浸提液10 mL，调节反应pH为5.0，分别反应 10、15、20、25、30、35 min，测定清除率。

1.2.3.6 正交试验选择最佳条件

根据上述5个单因素试验结果，选择影响亚硝酸盐清除效果的4个主要因素，进行L16（44）正交试验，找出茶叶浸提液清除亚硝酸盐的最佳工艺条件。

上述试验均重复3次。

1.2.4 亚硝酸盐清除率测定[16]

1.2.4.1 体外亚硝酸盐清除率测定

准确量取亚硝酸钠应用液两份各2 mL，分别置于50 mL容量瓶中，一份加入一定量的茶叶提取液，摇匀，反应一定时间。另一份做空白试验。（同时再吸取不同浓度的亚硝酸钠标准溶液置于比色管中，按下面的操作进行，最后以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线）。两份都加入0.4%对氨基苯磺酸溶液2 mL，摇匀静置4 min，加入1 mL 0.2%盐酸萘乙二胺，加入2 mL氯化胺缓冲液，加水定容至刻度；静置15 min，用1 cm比色皿以零管为空白，于540 nm处测得吸光度，分别计A1（加入茶叶浸提液测得值）、A2（未加入茶叶浸提液测得值）。

计算：清除率/%=[（A2-A1）/A2]×100

1.2.4.2 肉制品中亚硝酸盐清除率测定

取2份午餐肉匀浆各2 mL，其中一份加入茶叶浸提液（90℃水浴40 min），调节反应pH为5.0，反应20 min；另一份做空白。然后将匀浆全部洗入50 mL容量瓶中，按体外亚硝酸盐清除率测定方法操作比色。计算茶叶浸提液对肉制品中亚硝酸盐的清除率。

1.3 数理统计与分析方法

对所得数据用EXCEL数理统计分析软件整理、作图、制表，结果以平均值表示。所得数据用SPSS16.0软件进行SSR及LSR多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 影响茶叶浸提液对亚硝酸盐清除作用的主要因素

影响茶叶浸提液对亚硝酸盐清除作用的主要因素见图1。

由图 1（a、b、c、d、e）可以看出，浸提温度、浸提时间、浸提液用量及反应时间和反应液pH均会影响到茶叶浸提液对亚硝酸盐的清除效果，其中浸提液用量对清除率的影响表现为逐渐上升的趋势，其余因素对清除率的影响均表现为先上升后下降的趋势。以90℃浸提获得的茶叶浸提液对亚硝酸盐清除效果最好，为46.57%；以浸提40 min获得的茶叶浸提液对亚硝酸盐清除率最大，为52.45%；以反应20 min的清除率最大，为47.87%；以pH 5.0的反应液清除效果最好，为40.72%；以12 mL浸提液用量清除率最大，为51.74%，但用量10 mL与用量12 mL的清除率差异不大。

图1 影响茶叶浸提液对亚硝酸盐清除作用的因素Fig.1 The effect factors of tea extract on eliminating nitrite

2.2 正交优化确定茶叶浸提液清除亚硝酸盐的最佳工艺条件

根据上述单因素试验可知：反应至第20分钟时整个反应基本结束，所以该因素是一个固定的因素，因而选取浸提温度、浸提时间、浸提液用量和反应pH 4个因素（表1）进行L16（44）正交试验，以确定茶叶浸提液降低亚硝酸盐残留的最佳条件。正交结果见表2。

表1 正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

表2 正交试验结果Table 2 The results of the orthogonal test

从表2正交结果可知，各因素对降低肉制品中亚硝酸残留量的影响主次顺序为；茶叶浸提液用量C＞浸提温度A＞pH D＞浸提时间B。

进一步通过方差分析（表3）表明，茶叶浸提液用量C、浸提温度A、pH D对降低亚硝酸盐残留量的影响均达到0.05差异显著水平。结合正交试验K值分析与方差分析结果，对A、B、C 3个因素进行LSR法多重比较（表 4），结果表明 A2、C4、D2为清除亚硝酸盐的最优水平，但C3和C4差异不显著，D1和D2差异不显著。也就是说，K值分析与方差分析得出的最佳工艺条件为A2B2C4D2，即浸提温度90℃，浸提时间40 min，浸提液用量14 mL，反应液pH5.0。而根据清除率得出的最佳工艺条件为A2B4C3D2，即浸提温度90℃，浸提时间60 min，浸提液用量12 mL，反应液pH5.0（表2第8号正交试样）。

表3 方差分析表Table 3 The table of variance analysis

表4 A因素和C因素各水平LSR法多重比较Table 4 Multiple comparison of each lever typical value of A and C by LSR

将两组工艺条件A2B2C4D2与A2B4C3D2进行对照实验，测定清除率。其结果如表5所示。

表5 两种最佳工艺条件的清除率比较Table 5 Elimination rate comparison of two kinds of the optimum elimination conditions

由表5可以看出，茶叶浸提液降低亚硝酸盐残留量的最佳工艺条件为A2B4C3D2，即取90℃水浴浸提60 min的茶叶浸提液12 mL，在pH5.0的反应液中反应20 min，对体外亚硝酸盐的清除率可达56%以上。

2.3 最佳试验组茶叶浸提液清除肉制品中亚硝酸盐的效果

为了明确上述最佳工艺条件下获得的茶叶浸提液对肉制品中亚硝酸盐的清除率，试验以午餐肉和火腿肠为材料，测定了其对亚硝酸盐的清除率，结果见表6。

表6 最佳试验组茶叶浸提液清除肉制品中亚硝酸盐的效果Table 6 Eliminating effects of the optimum tea extract on nitrite of meat products

从表6可以看出，茶叶浸提液对午餐肉和火腿肠中亚硝酸盐的清除率分别为48.14%和44.45%。可见茶叶浸提液对肉制品中亚硝酸盐的清除效果较好。

3 讨论

3.1 制备茶多酚的方法

目前从茶叶中制备茶多酚的传统方法主要分为以下3类[14]：（1）溶剂提取法，即将茶叶用极性溶剂浸渍，然后把浸取液进行液—液萃取分离，最后浓缩得到产品。由这种方法制取的茶叶浸提液为粗提纯液，产品收率在5%～10%之间。（2）离子沉淀法，用金属沉淀茶多酚，使其与咖啡碱分离。由于此方法使用了对人体有毒的重金属作沉淀剂，所以，生产的产品难以达到食品和医药行业的要求。（3）柱分离制备法，已有报道的凝胶柱、吸附柱和离子交换柱法。此项技术的关键是柱填充料和淋洗。研究表明，采用柱分离制备法，茶多酚获得率在4%～8%之间，但柱填充料非常昂贵，而且淋洗时要用多种且大量的有机溶剂，显然不适合工业化生产。因此，考虑到产品安全性、价格和纯度等多种因素，本试验选择第一种制备方法，即溶剂提取法制备获得茶多酚。

3.2 茶叶浸提液清除亚硝酸盐残留的影响因素

由试验结果可以看出，影响茶叶浸提液清除亚硝酸盐残留的主要因素是浸提液用量、浸提温度及反应液pH。由于提取茶多酚工艺对试验设备及作业环境要求严格，提取技术难度大，因此本试验茶叶浸提液里的主要成份并非完全是茶多酚类物质，可能还含有大量的咖啡类及色素类等影响试验准确程度的物质，因此本试验最关键的步骤就是确定浸提液中茶多酚含量及浸提液用量。当茶叶浸提温度接近90℃时，浸提液中的茶黄素、茶红素和茶褐素与咖啡碱之间呈离子状态，从而进行分光光度值的准确测定；而随着温度降低，茶多酚容易与茶叶中的咖啡碱通过氢键的缔合作用生成络合物（如茶乳酪），从而表现出胶体特征[17]，影响分光光度值的准确测定。同时由于茶多酚容易氧化变质，因此制备过程中要尽量小心浸提液被氧化，要使茶叶浸提液保存在相对密闭的环境中，防止其中的茶多酚被氧化成茶黄素、茶红素和茶褐素等一系列有色化合物而影响被测物质的分光光度值。另外茶叶浸提液在酸性环境中的清除效果要好于碱性条件下，这主要是因为茶多酚类物质呈弱酸性且在pH 4～7下较为稳定。

由于茶多酚特有的天然抗氧化能力不会影响肉制品的保质期与风味，因此笔者认为，随着在生物技术领域内天然大分子物质提取技术的不断改进，茶多酚类物质作为一种良好的天然食品添加剂以及其特有的抗氧化、改善食品风味和延长食品贮存期的特点，将在食品添加剂领域内有很乐观的市场前景和可观的经济效益。