红花中羟基红花黄色素A的分离纯化工艺Δ

唐 红，董 志，曹纬国，肖晓秋，刘 媛，程玉洁，王乐乐（重庆医科大学药学院，重庆 400016）

红花为菊科红花属植物红花（Carthamus tinctoflus L）的干燥花，夏季花由黄变红时采摘，阴干或晒干，产于河南、新疆、四川等地，具有祛瘀止痛的功效。药理研究表明，红花黄色素具有扩张冠脉、抗氧化、保护心肌、降血压、免疫抑制和脑保护等255种药理学功效。临床上常用于冠心病、高血压、心脑血管等疾病的预防和治疗[1，2]，常以水煎液入药。羟基红花黄色素A（Hydroxysafflor Yellow A，HSYA）是一种查耳酮苷类物质，是红花黄色素中含量较高的一种水溶性成分，具有药理效应代表性，且为单体，无明显的毒副作用，有着极好的新药开发前景。笔者采用温浸法对主要的活性物质进行提取、分离、纯化，并对其最终含量进行测定[3～5]。

1 仪器与试药

UV-3150 PS（E）紫外分光光度计（日本津岛公司）；RE-52 AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-3循环水多用真空泵、DT-100 A型分析天平（北京光学仪器厂）；PYXHXZ电动振荡器（广东韶关科力实验仪器有限公司）；GSY-Ⅱ不锈钢电热恒温水浴锅（北京市医疗设备厂）。

红花购自重庆市药材市场，经重庆医科大学中医药学院何先元副教授鉴定为菊科川红花（Carthamus tinctorius L.）的干燥花（贮藏于室温的干燥器中）；HSYA对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111637-200905，纯度：91.8%）；ZTCⅡ型天然澄清剂（含A、B组分，天津天成澄清剂有限公司）；D4020、D101、D3520、AB-8、ADS-17、X-5型大孔树脂（天津南开大学化工厂）；聚酰胺薄膜、80～100目聚酰胺树脂（浙江台州四甲生化塑料厂）；其余试剂均为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 红花粗提液的制备

称取400 g红花药材，第1次提取加入药材量12倍的超纯水，70℃水温浸泡30 min，第2次提取加入10倍量的超纯水，70℃水温浸泡20 min，合并2次提取液，按1∶2比例60℃减压浓缩，加入浓缩后药液体积6%的ZTCⅡ型澄清剂B组分（置于70℃水浴中），絮凝30 min，再加入3%ZTCⅡ型澄清剂A组分，絮凝60 min后抽滤除去沉淀，60℃减压浓缩至提取液含生药1 mg·mL－1，上柱备用。

2.2 大孔树脂分离HSYA

2.2.1 树脂的预处理 分别将D101、D4020、D3520、ADS-17、AB-8、X-5型大孔树脂置于95%乙醇中浸泡24 h，湿法装柱，用95%乙醇洗至取流出液1mL，加4mL超纯水洗至无浑浊现象，再用超纯水洗至无醇味，备用。

2.2.2 静态吸附筛选最佳树脂型号 称取5.0 g预处理好的6种湿树脂，分别加入到100mL带塞锥型瓶中，每种树脂称3份，加入10 mL粗提液，置于28℃、120 r·min－1恒温振荡器上振荡24 h，吸附平衡后，采用紫外-可见分光光度法（检测波长：403 nm；回归方程：Y＝42.585 X－0.0287（r＝0.9999））测定吸附后溶液中HSYA含量。根据下式计算不同型号大孔树脂的静态吸附量（Q，mg·g－1）、吸附率（%）：Q＝（ρ0ν0－ρeνe/m）×100%、吸附率＝（ρ0ν0－ρeνe/ρ0ν0）×100%（式中，ρ0为吸附前溶液中HSYA的总质量浓度；ν0为吸附前溶液总体积；ρe为吸附饱和后溶液中HSYA的总质量浓度；νe为吸附后溶液的总体积；m为树脂质量）。结果，D101、D4020、D3520、ADS-17、AB-8、X-5型大孔树脂的Q分别为0.3209、0.3256、0.2829、0.3147、0.3234、0.3325mg·g－1，吸附率分别为 91.8%、93.15%、81.95%、90.04%、92.55%、95.15%，X-5型大孔树脂的Q和吸附率均较高，故选择X-5型大孔树脂。

2.2.3 静态吸附筛选洗脱液浓度 将吸附液滤去，分别向达到吸附平衡的树脂中加入30%、50%、70%的乙醇溶液（每组进行3次平行试验），28℃下连续振摇12 h，测定此解吸液中HSYA的含量，按下式计算不同浓度的乙醇溶液的解吸附率（%）：解吸附率＝（ρdνd/ρoνo－ρeνe）×100%（式中，ρd为解吸液中的HSYA总质量浓度；νd为解吸液体积）。结果，乙醇浓度为50%时，平均解吸附率达到了98.21%，对HSYA的洗脱效果最佳。不同浓度乙醇对HSYA解吸附的影响见图1。

图1 不同浓度乙醇对HSYA解吸附的影响Fig 1 Effects of different concentration of ethonal on desorption of HSYA

2.2.4 静态吸附筛选提取液的pH值 称取6份质量为5 g的X-5型大孔树脂，分别置于250 mL锥形瓶中，加入pH值分别为1、2、3、4、5、6的红花粗提液（质量浓度为0.383 mg·mL－1）各20 mL，恒温搅拌，每隔5 min振荡30 s，持续2 h，然后静置24 h，使其达到饱和吸附状态。分别测定吸附后溶液中HSYA含量，计算不同pH值下的Q。结果，当pH值分别为1、2、3、4、5、6时，Q分别为0.3760、0.3762、0.3831、0.3795、0.3818、0.3796 mg·g－1，当pH值为3时的Q最大，故选择提取液的pH值为3。

2.2.5 动态吸附筛选不同流速 量取4份10 mL经过预处理的X-5型大孔树脂，分别装入内径2 cm的层析柱，加入红花粗提液5 mL，分别控制流速为1.0、1.5、2.0、2.5 mL·min－1，分段收集流出液，测定流出液中HSYA含量，并计算吸附率和解吸附率。结果，流速控制在1mL·min－1时吸附率和解吸附率最佳。不同流速对HSYA吸附和解吸附的影响见图2。

2.2.6 动态吸附筛选不同径高比 将红花粗提液上X-5型大孔树脂层析柱（2 cm×40 cm），上样量固定为柱体积的2%，流速为1 mL·min－1，径高比分别为1∶8、1∶10、1∶12，1∶15，测定HSYA的吸附率和解吸附率。结果，径高比分别为1∶8、1∶10、1∶12、1∶15时的吸附率分别为93.3%、94.1%、94.8%、95.2%，解吸附率分别为89.7%、88.9%、93.6%、90.3%，表明径高比为1∶12时的分离效果较好。

图2 不同流速对HSYA吸附和解吸附的影响Fig 2 Effects of different flow rates on adsorption and desorption of HSYA

2.2.7 动态吸附筛选上样量 将红花粗提液上X-5型大孔树脂（2 cm×40 cm）层析柱，径高比为1∶12，流速为1 mL·min－1，上样液pH值为3，分别以1%、2%、3%、4%柱体积上样，测定HSYA的吸附率和解吸附率。结果，上样量分别为1%、2%、3%、4%柱体积时，吸附率分别为94.6%、95.3%、90.4%、91.2%，解吸附率分别为88.6%、92.8%、91.3%、89.7%，表明上样量为2%时分离效果最佳。

2.2.8 大孔树脂分离HSYA的工艺 将浓缩得到已知浓度的红花粗提液上X-5型大孔吸附树脂，采用2%柱体积红花粗提液上样，径高比为1∶12，洗脱速度为1 mL·min－1，先用150 mL超纯水洗脱，待流出液Molish反应呈阴性时以400 mL50%乙醇洗脱，分段接取洗脱液，以HSYA为对照品进行聚酰胺薄膜法检视，点样后以乙酸乙酯-甲醇-3.6%盐酸（1∶3∶6）为展开剂展开，在紫外光灯（254 nm）下检视。当洗脱液在HSYA对照品荧光斑点对应处无斑点显示时，表明HSYA成分基本洗脱完全，收集含HSYA成分的洗脱液，备用。

2.3 聚酰胺树脂法纯化HSYA

采用聚酰胺树脂对HSYA进行动态吸附，按“2.2”项下方法筛选得到聚酰胺树脂纯化HSYA工艺为径高比1∶14，上样量为2%柱体积，流速为1.5 mL·min－1，洗脱溶剂为乙酸乙酯-甲醇-3.6%盐酸（1∶3∶6），反复上柱6次。直至样品的主斑点与HSYA对照品的Rf值一致，基本无杂质斑点即可。干燥后的粉末采用紫外-可见分光光度法测定HSYA含量为83.65%。

3 讨论

本研究通过静态吸附试验考查了不同极性、比表面积和孔径大小的6种大孔树脂对HSYA的吸附和解吸附效果的影响[6]，筛选出了对HSYA吸附-解吸附效果较好的X-5型大孔树脂。非极性的X-5型大孔树脂对HSYA的吸附可逆性好，回收率高；而非极性的D3520、D4020和ADS-17型大孔树脂由于极性低，比表面积和平均直径较小导致其对HSYA的吸附量较小；弱极性AB-8型大孔树脂对HSYA吸附作用力强，解吸较低，不适用于对HSYA的分离及树脂的重复利用，并增加生产成本。因此，最终选择X-5型大孔树脂对HSYA进行分离。

ZTCⅡ型澄清剂分为A、B两组分，它是以天然多糖等为原料制成的食品添加剂，安全无毒，澄清对象为蛋白质、鞣质、蜡质等[7]。本试验结果显示：该澄清剂使用方便，有效成分损失小。大孔树脂是一类有机高聚物吸附剂，是一种非凝胶型，注有致孔剂，不含交换基团，含有“空隙”结构的聚合物，特别适合从水溶液中分离化合物。将澄清剂法与大孔树脂法结合，能够降低成本，提高除杂效率。通过对影响大孔树脂吸附与解吸附的各种因素的系统研究，最后选定了最佳分离、纯化工艺，在此条件下得到HSYA的产率为25.63%，纯度为83.65%。

[1]施 峰，刘焱文.红花的化学成分及药理研究进展[J].时珍国医国药，2006，17（9）：1666.

[2]张吉祥，白晓杰，周秋香，等.大孔吸附树脂分离纯化红花黄色素的研究[J].时珍国医国药，2009，20（8）：1950.

[3]臧宝霞，王玉芹，李家实，等.分光光度法测定红花黄色素的含量[J].药物分析杂志，2002，22（2）：137.

[4]关颖丽，刘建宇，尹 虹.D101型大孔吸附树脂在分离纯化三萜苷方面的应用[J].中国药房，2008，19（30）：2399.

[5]金 鸣，高子淳，李金荣.大孔树脂柱色谱法制备红花黄色素和羟基红花黄色素A[J].中草药，2004，35（1）：25.

[6]徐小燕，潘林梅.影响大孔树脂吸附分离的因素及其在中药制备工艺中的应用[J].中国药房，2007，18（9）：719.

[7]杨 辉，阿依吐伦·斯马义，吴桂荣，等.羟基红花黄色素A的提取及含量测定[J].新疆医科大学学报，2008，31（10）：1358.