牛蒡根4种提取物体外抗肿瘤活性的比较研究Δ

赵秀梅，张富赓，沈洪昇，史鹏程，胡人杰#（.天津市医药科学研究所，天津 30000；.天津市环湖医院，天津 300060）

牛蒡（Arctium lappa L.），别名恶实根，属于菊科牛蒡属2年生草本植物[1]。牛蒡根为牛蒡的根，主要作为蔬菜或制成保健品广为食用。目前，对牛蒡根的研究主要集中在抗菌、降血糖、抗衰老及其抗突变方面[2，3]，其抗肿瘤活性方面的研究几乎是空白。笔者采用系统溶剂提取法对牛蒡根进行提取和初步分离，选择人乳腺癌细胞MCF-7、人胃腺癌细胞BGC-823、小鼠肝癌细胞HepA、小鼠肉瘤细胞S180和小鼠脾淋巴细胞为观察对象，对不同极性提取物的生物活性进行初步观察、比较，探讨牛蒡根的进一步研发价值。

1 仪器与材料

1.1 仪器

CO2孵育箱（美国Revco公司）；Infinite M200 PRO型全波长多功能酶标仪（奥地利Tecan公司）；CKX41型倒置显微镜（日本Olympus公司）；96孔板（德国Greinerbio公司）。

1.2 试药

牛蒡根为市售品，由天津中医药大学马琳研究员鉴定为真品；RPMI 1640培养基（美国Gibco公司）；MTT、刀豆蛋白A（Con A）均购自北京欣经科生物技术有限公司；小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；二甲基亚砜（DMSO，天津瑞金特化学品有限公司）；石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇（天津市化学试剂批发公司）。

1.3 动物与细胞株

昆明种小鼠，♀♂兼用，体重18～20 g，由北京大学医学部实验动物科学部提供（动物生产许可证号：SCXK（京）2006-2008）。

人乳腺癌细胞株MCF-7、人胃腺癌细胞株BGC-823、小鼠肝癌腹水型细胞株HepA和小鼠肉瘤腹水型细胞株S180均由天津市医药科学研究所细胞室提供。

2 方法

2.1 样品的制备

取牛蒡根干燥粗粉适量，乙醇回流提取3次，合并醇提液，减压回收溶剂，浸膏加适量水成混悬液，依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取。将各萃取液分别浓缩，得石油醚层、氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层。用前以含10%小牛血清的RPMI 1640培养液配制并进行倍量稀释。

2.2 样品对体外培养肿瘤细胞生长的影响[4]

取对数生长期MCF-7和BGC-823细胞，经0.25%胰酶消化后，吹打成单细胞悬液，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞浓度为1×105个/mL，以每孔100 μL分别接种于96孔培养板中，培养24h待细胞贴壁。另外再抽取HepA和S180细胞小鼠腹水，PBS洗涤2次，用含10%小牛血清的RPMI 1640液稀释成1×106个/mL单细胞悬液，分别接种于96孔培养板中，每孔100 μL。

于上述96孔板中加入不同浓度的待测样品液100 μL，每个浓度平行4孔。以加入等体积含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，使反应体积为200 μL为对照。37℃、5%CO2培养箱中培养72 h后，每孔加入5 mg·mL－1MTT液10 μL，37℃温育4 h，1000 r·min－1离心10 min，小心吸去上清液，每孔加人180 μL DMSO，震荡，于酶标仪570 nm波长处测吸光度（A）值。药物半数抑制浓度（IC50）用SPSS13.0软件进行计算。按下式计算药物各个浓度对肿瘤细胞的生长抑制率（IR）：IR（%）＝（1－样品平均A值/对照平均A值）×100%。

2.3 样品对淋巴细胞增殖的影响[5]

小鼠颈椎脱臼处死，无菌条件下摘取脾脏，收集脾细胞。用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞浓度至4×106个/mL。以每孔75μL加于96孔板中，再加入20μg·mL－1Con A溶液25 μL，其余步骤如复孔、对照孔的设置，待测样品的加入，细胞的培养以及MTT的加入，均按“2.2”项下方法操作，并测定A值。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 牛蒡根提取物对体外肿瘤细胞生长的影响

3.1.1 牛蒡根提取物对MCF-7细胞、BGC-823细胞生长的影响 与对照组比较，牛蒡根石油醚、氯仿、乙酸乙酯提取物对MCF-7和BGC-823细胞的生长均表现出一定的抑制作用。对MCF-7细胞的IC50分别为（213.43±104.38）、（276.42±87.85）、（235.67±189.48）μg·mL－1；对BGC-823细胞的 IC50分别为（380.83±62.64）、（336.21±44.11）、（564.65±84.85）μg·mL－1。牛蒡根提取物对MCF-7细胞生长的抑制作用由强到弱为：石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、氯仿提取物；牛蒡根提取物对BGC-826细胞生长的抑制作用由强到弱为：氯仿提取物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物。正丁醇提取物在测试的浓度范围内对MCF-7和BGC-823细胞没有显示出细胞毒活性。牛蒡根提取物对MCF-7细胞、BGC-823细胞生长的影响分别见表1、表2。

表1 牛蒡根提取物对MCF-7细胞生长的影响（n＝4）Tab 1 The effect ofA.lappa root extracts on the proliferation of MCF-7cells（n＝4）

表2 牛蒡根提取物对BGC-823细胞生长的影响（n＝4）Tab 2 The effect ofA.lappa root extracts on the proliferation of BGC-823cells（n＝4）

3.1.2 牛蒡根提取物对HepA细胞、S180细胞生长的影响 牛蒡根石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物在各浓度范围内对小鼠HepA、S180细胞均表现出不同程度的生长抑制作用，量效关系基本明确。各提取物对HepA细胞的IC50分别为（56.12±21.47）、（52.85±19.41）、（49.52±36.56）、（84.13±36.69）μg·mL－1；对S180细胞的IC50分别为（7.34±1.65）、（5.36±0.76）、（64.14±12.63）、（33.29±12.14）μg·mL－1。牛蒡根提取物对HepA细胞生长的抑制作用由强到弱为：乙酸乙酯提取物、氯仿提取物、石油醚提取物、正丁醇提取物；牛蒡根提取物对S180细胞生长的抑制作用由强到弱为：氯仿提取物、石油醚提取物、正丁醇提取物、乙酸乙酯提取物。牛蒡根提取物对HepA细胞、S180细胞生长的影响分别见表3、表4。

3.2 牛蒡根提取物对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

4种提取物对小鼠脾淋巴细胞（主要是T淋巴细胞）的增殖表现出了明确的抑制作用，这种作用基本上呈剂量依赖性。牛蒡根石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物对淋巴细胞增殖抑制的 IC50分别为（22.22±4.90）、（32.15±3.45）、（31.66±10.65）、（126.45±47.32）μg·mL－1。牛蒡根提取物对脾淋巴细胞生长的抑制作用由强到弱为：石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、氯仿提取物、正丁醇提取物。牛蒡根提取物对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响见表5。

4 讨论

表3 牛蒡根提取物对HepA细胞生长的影响（n＝4）Tab 3 The effect ofA.lappa root extracts on the proliferation of HepAcells（n＝4）

表4 牛蒡根提取物对S180细胞生长的影响（n＝4）Tab 4 The effect of A.lappa root extracts on the proliferation of S180cells（n＝4）

表5 牛蒡根提取物对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响（n＝4）Tab 5 The effect of A.lappa root extracts on the proliferation of mice spleens lymphocytes（n＝4）

人们对于牛蒡的研究主要集中于其法定的药用部位牛蒡子，并已证明其化学成分牛蒡苷具有抗肿瘤活性。牛蒡的非药用部位牛蒡根作为食品在日本、韩国以及我国台湾地区受到推崇。

本研究发现，牛蒡根4种不同极性提取物中石油醚、氯仿、乙酸乙酯提取物对体外培养的HepA、S180、MCF-7、BGC-823细胞均表现出明确的生长抑制作用。笔者首次确定了牛蒡根的体外抗肿瘤作用。但研究结果也显示，MCF-7、BGC-823细胞对样品的IC50值明显高于HepA、S180细胞，这可能是由于作为悬浮生长小鼠的肿瘤细胞比贴壁生长的人肿瘤细胞对样品有更高的敏感度，而且从体积上来讲，小鼠的肿瘤细胞也要小于贴壁细胞。研究中笔者还发现，所有样品对ConA诱导的淋巴细胞增殖均表现出明确的抑制作用，表明牛蒡根的抗肿瘤作用机制与增强细胞的免疫活性无关。以上研究结果均表明牛蒡根提取物确有细胞毒活性。此外，在另一研究中笔者对牛蒡根和牛蒡子进行了初步的成分分析。结果发现，牛蒡根中不含有牛蒡子中特有的抗肿瘤活性成分牛蒡苷，说明牛蒡根中的抗肿瘤活性成分很可能不同于牛蒡子。以往研究证实，菊科植物中含有炔类化合物[6]。20世纪60年代，日本学者从牛蒡根中分离得到了炔类化合物，并证实其具有抗菌活性，而近年来的研究表明，炔类化合物很可能具有抗肿瘤的生物活性[7]。本研究中牛蒡根的抗肿瘤生物活性，是否与其所含的“炔类化合物”相关，有待进一步考察，笔者认为开发牛蒡根作为抗肿瘤的药物或食品具有一定的物质基础。对于牛蒡根提取物中有关“活性成分”的分离和药理学评价尚在进行中，期望得到良好的结果。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：60.

[2]李时珍.本草纲目（校点本第二册）[M].第1版.北京：人民卫生出版社，1987：985.

[3]时新刚，王 晓，李赛钰，等.牛蒡食用价值的研究与分析[J].山东食品发酵，2003，4：28.

[4]邵振中，贾晓斌，陈 彦，等.三草方不同极性部位及其配伍后对人肺腺癌SPC-A-1细胞的影响研究[J].中国药房，2010，21（7）：581.

[5]马丽娟，李 鹏，宋 宇，等.马蹄香含药血清对小鼠脾淋巴细胞和腹腔巨嗜细胞的影响[J].安徽农业科学，2010，38（29）：16230.

[6]王建平，秦红岩，张惠云，等.鬼针草提取成分对白血病细胞的体外抑制作用[J].中药材，1997，20（5）：247.

[7]赵秀梅，胡人杰.天然炔类化合物的研究现状[J].天津药学，2007，19（1）：60.