褐藻多糖硫酸酯精提物对慢性肾衰模型大鼠的保护作用研究Δ

李娟，何海霞，周远大#，郝守祝（.重庆医科大学附属第一医院药学部，重庆40006；.北京世纪博康医药科技有限公司，北京 00070）

慢性肾衰竭（Chronic renal failure，CRF）是各种原因导致肾脏慢性进行性损害，使其不能维持基本功能，临床以代谢产物和毒素的潴留，水、电解质和酸碱平衡紊乱以及某些内分泌功能异常等表现为特征的一组综合征。目前，晚期慢性CRF患者只能依赖肾脏替代疗法（透析、肾移植）来延长生命。在CRF治疗过程中，尤其是对早、中期CRF，中医药（特别是利用海带、昆布等海洋药物）有着自身的特殊优势和丰富的临床经验。据文献报道[1～3]，褐藻多糖硫酸酯（Fucoidan sulfate，FS）具有改善肾功能、延缓病情进展的功效。但目前临床上应用的FS仅是粗提物，由岩藻糖、半乳糖、木糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖等单糖和硫酸基组成，总有效成分含量仅50%左右；其精提物（Refined fucoidan sulfate extraction，RFSE）为高纯度的单一组分，由岩藻糖、半乳糖和硫酸基组成，总有效成分含量可达90%以上[4]。本研究通过复制腺嘌呤所致大鼠CRF模型，探究RFSE对CRF的疗效，为临床用药提供理论参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

ALCYON300型全自动生化测定仪（美国雅培公司）；MEK-6108K型血液分析仪（日本光电公司）。

1.2 试药

腺嘌呤（新乡拓新化工厂，批号：060504）；醋酸地塞米松片（天津天药药业股份有限公司，批号：20050545）；RFSE、FS（北京世纪博康医药有限公司）；尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）、总蛋白、白蛋白、考马斯亮蓝试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 动物

清洁级SD大鼠88只，♂，体重180～240 g，由重庆医科大学实验动物中心提供（动物使用合格证号：SCXK（渝）20070001）。

2 方法与结果

2.1 统计学方法

2.2 模型的复制与分组、给药

取SD大鼠88只，随机抽取10只作为正常对照，其余大鼠ig 365 mg·kg－1腺嘌呤复制CRF模型，每天1次，连续20 d。于复制模型结束后，根据血清Scr和BUN的含量，选取复制模型成功的大鼠60只，参考文献[5]随机分成6组，即模型（1%羧甲基纤维素钠）、地塞米松（0.1 mg·kg－1）、FS（100 mg·kg－1）和RFSE高、中、低剂量（100、50、25 mg·kg－1）组。ig给药，给药容量为1 mL·100 g－1，每天2次，连续25 d。

2.3 RFSE对模型大鼠一般状况、24 h尿量和尿蛋白的影响

观察大鼠的精神状态、活动状况、体重、体毛、大小便、摄食和饮水状况。于末次给药后，将大鼠分别置于代谢笼中收集24 h尿量，并以考马斯亮蓝法检测尿蛋白。

结果，正常对照组大鼠体毛呈白色、有光泽、顺滑，无脱毛现象，饮食正常，反应灵敏。模型组大鼠毛色日渐变灰、无光泽、不顺滑，脱毛现象严重，精神萎靡，活动缓慢且减少，饮食、尿量减少，体重进行性下降。各用药组较模型组上述情况有不同程度的改善，其中以RFSE高剂量组的一般状况最好。

与正常对照组比较，模型组24 h尿量、24 h尿蛋白均显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，RFSE高、中、低剂量组24 h尿量均显著降低（P＜0.05），高剂量RFSE作用尤为显著；RFSE高、中、低剂量组24 h尿蛋白均显著减少（P＜0.01）。与FS组比较，RFSE高剂量组24 h尿蛋白显著减少（P＜0.01）。各组大鼠24 h尿量和尿蛋白比较见表1。

表1 各组大鼠24 h尿量和尿蛋白比较（±s，n＝10）Tab 1 Comparison of urine volume and protein in 24 hours among those groups（±s，n＝10）

表1 各组大鼠24 h尿量和尿蛋白比较（±s，n＝10）Tab 1 Comparison of urine volume and protein in 24 hours among those groups（±s，n＝10）

与正常对照组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01；与FS组比较：△P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01；vs.FS group：△P＜0.01

组别正常对照组模型组地塞米松组FS组RFSE高剂量组RFSE中剂量组RFSE低剂量组24 h尿量/mL 11.10±6.9725.40±15.51＊15.20±8.46#20.10±12.5611.12±14.10#16.10±14.81#17.97±7.53#24 h尿蛋白/mg 5.6±1.4735.13±6.93＊18.03±6.71##12.97±5.12##7.57±2.82##△15.98±6.50##18.73±5.61##

2.4 RFSE对模型大鼠血常规和血液生化指标的影响

大鼠末次给药后禁食24 h，取血5～6 mL，抗凝血测定红细胞数（RBC）、血红蛋白（Hb），并测血清Ca2+、P3+、BUN和Scr含量。

与正常对照组比较，模型组RBC和Hb的含量显著减少（P＜0.05）；Scr、BUN和P3+的含量显著增加（P＜0.01）。与模型组比较，RFSE高、中、低剂量组RBC和Hb的含量略有增加，但无显著性差异（P＞0.05）；Scr、BUN和P3+的含量显著减少（P＜0.01或P＜0.05）。与FS组比较，RFS高、中、低剂量组RBC、Hb、Scr、BUN、Ca2+、P3+无显著性差异（P＜0.05）。各组大鼠血液学指标比较见表2；各组大鼠血液生化指标比较见表3。

表2 各组大鼠血液学指标比较（±s，n＝10）Tab 2 Comparison of hematology index in rats among those groups（±s，n＝10）

表2 各组大鼠血液学指标比较（±s，n＝10）Tab 2 Comparison of hematology index in rats among those groups（±s，n＝10）

与正常对照组比较：＊P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.01

组别正常对照组模型组地塞米松组FS组RFSE高剂量组RFSE中剂量组RFSE低剂量组RBC/1012·L－16.53±0.334.92±0.55＊6.64±0.54#5.79±0.41#5.10±0.235.23±0.365.15±0.40 Hb/g·L－1126.20±5.53100.50±9.61＊133.40±7.52#116.60±4.95#104.50±4.14107.20±5.77104.40±6.35

表3 各组大鼠血液生化指标比较（±s，n＝10）Tab 3 Comparison of biochemical indicator in rats among those groups（±s，n＝10）

表3 各组大鼠血液生化指标比较（±s，n＝10）Tab 3 Comparison of biochemical indicator in rats among those groups（±s，n＝10）

与正常对照组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

组别正常对照组模型组地塞米松组FS组RFSE高剂量组RFSE中剂量组RFSE低剂量组Scr/μmol·L－1115.10±6.89231.78±59.25＊127.20±13.62##122.42±14.93##122.43±7.99##125.92±24.03##126.35±16.75##BUN/mmol·L－15.52±1.4123.92±9.34＊12.19±2.99##13.00±2.48##12.02±2.67##13.64±4.48#14.54±5.20#Ca2+/mmol·L－12.35±0.122.24±0.392.45±0.152.31±0.182.12±0.142.13±0.182.14±0.21 P3+/mmol·L－12.49±0.154.48±1.04＊2.62±0.15##2.77±0.30##2.82±0.28##2.93±0.21##2.72±0.22##

2.5 RFSE对模型大鼠肾脏组织病理形态学的影响

麻醉处死大鼠，取肾组织行病理形态学观察。参考文献[6]，并结合观察情况，对肾小球、肾小管-间质病变进行半定量分级。“－”级：肾小球、肾小管、间质正常；“+”级：变性肾小球数目小于肾小球总数的1/3，肾小管坏死面积小于皮质面积的1/3，间质轻度水肿伴纤维组织增生；“++”级：变性肾小球数目占肾小球总数的1/3～2/3，肾小管坏死面积占皮质面积的1/3～2/3，间质中度水肿伴纤维组织增生；“+++”级：变性肾小球数目超过肾小球总数的2/3，肾小管坏死面积超过皮质面积的2/3，间质重度水肿伴纤维组织增生。

与正常对照组比较，模型组大鼠肾脏组织病理改变显著。与模型组比较，RFSE高、中剂量组肾小管-间质分级情况显著降低（P＜0.01）。与FS组比较，RFSE高、中剂量组病理情况显著改善（P＜0.01）。大鼠肾脏组织病理改变比较见表4；肾脏病理切片见图1。

3 讨论

研究表明[7]，通过腺嘌呤复制的CRF模型与人类CRF所表现出来的代谢紊乱十分接近。因此，本研究应用此模型来研究RFSE对CRF的保护作用。血清Scr、BUN作为CRF诊断及严重程度分级的主要指标，又与患者多种临床症状如恶心、呕吐、心悸、胸闷、皮肤瘙痒与各种出血的发生率呈正相关，故降低血中这些毒素成为缓解肾功能衰竭的重要任务[8]。蛋白尿是预示肾病进展与预后的重要标志之一，其对肾小球上皮细胞与近曲小管细胞等都有损伤作用；且大量蛋白尿超过肾小管重吸收能力，在肾小管内形成管形尿，加重上皮细胞损害与间质炎症，故控制尿蛋白对CRF患者有重要意义。CRF在表现上除了肾脏功能有一定的改变，还存在不同程度的贫血，因为促红细胞生成素90%在肾脏分泌，肾功能减退必然会引起促红细胞生成素的分泌减少而导致贫血[9]，故检测RBC和Hb是作为急慢性肾衰鉴别诊断的重要依据[10]。另外，由于CRF还存在电解质紊乱以及不同程度的肾脏病理改变，故也应进行相应考察。

表4 大鼠肾脏组织病理改变比较Tab 4 Comparison of pathological changes of renal tissue in rats

图1 肾脏病理切片图（HE，100×）Fig 1 Pathological photograph of kidney（HE，100×）

RFSE是从海洋中药海带中制备获得的一种由岩藻糖、半乳糖和硫酸基组成的新结构高纯度的低分子硫酸多糖类药物。其研制依据就是根据传统中医理论以及中医文献古籍关于海带、昆布利水泻浊作用，针对湿浊内阻证肾病综合征肾功能衰竭的病因病机，突出中医治疗肾病的优势，结合海洋药物研究的最新进展和现代提取工艺而确立的。本研究结果表明，高、中、低剂量RFSE均可显著改善模型大鼠的精神状态、摄食等一般状况，能显著降低模型大鼠血清中Scr、BUN和P3+的水平，减少腺嘌呤所致的24 h尿量和尿蛋白的增加；高、中剂量RFSE还可使模型大鼠的肾脏病理改变得到一定程度的改善；各剂量RFSE对RBC和Hb的含量降低也显示了一定的缓解作用。与同等剂量的FS比较，RFSE对24 h尿量、尿蛋白和肾脏病理改变的影响作用较好。提示RFSE对腺嘌呤所致大鼠肾功能损害有较好保护作用，能较好的延缓肾衰的进展，但至于具体的作用机制还有待进一步的研究。

综上所述，RFSE在连续多次给药的过程中，对腺嘌呤所致大鼠肾功能损害显示了较好的保护作用；而且前期研究显示RFSE急性毒性实验ip的半数死亡剂量是FS的近5倍，相对于FS具有更高的安全性，能够满足CRF患者长期用药的需要，是一种理想的治疗肾衰竭的药物，值得进一步应用于临床研究。

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