骨膜牵张成骨修复腭裂的荧光组织化学分析＊

蒋程程，邓金勇 ，宋庆高，何 苇 ，陈 尚

(遵义医学院附属口腔医院口腔颌面外科，贵州遵义 563099)

骨膜牵张成骨(periosteal distraction osteogenesis，PDO)是一种通过诱导骨膜间充质干细胞分化为成骨细胞后进而获得新生骨的缓慢生物学过程，但这种成骨方法不同于牵张成骨技术，PDO不需截骨术或骨皮质切开术，仅是对骨皮质表面的骨外膜进行牵张［1］。目前可通过多种方法来对实验成骨效果进行评估，如超声波检查、X线检查［2］、CT 扫描［3］、生物力学检测［2］、组织学观察［3］等。本课题组已成功将PDO技术应用在犬腭裂模型上，并通过腭裂骨缘组织学观察得到骨膜成骨良好的结论［4］。本实验将进一步对其成骨过程进行荧光组织化学分析，以研究骨膜牵张成骨的连续过程及规律，为临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1．1 实验设计 12～14月龄的健康杂种犬10只，雄性，体重10～15 kg。随机分组，空白对照组2只，饲养60 d后处死;实验组8只随机分为四组，每组2 只，牵张 20、30、40、60 d 后处死，牵张器放置侧为实验侧，未放置侧为自身对照侧。

1．2牵张装置［4］本实验采用的镍钛记忆合金牵张器为自行设计并制作，主体分为两部分:施力部分与固位部分。该材料具有良好的超弹性及形状记忆效应，即在一定范围内，随着环境温度的变化，牵张器发生形变后可以产生恒定的牵张力。本实验所选用的骨膜牵张器在有效作用范围内的牵张力值为250±20g。

1．3 手术方法 实验组在全麻下于腭中缝处切除长约2．0 cm、宽约0．6 cm的全层组织，形成人工硬腭裂。模型建立2月后，行第2次手术安置牵张器:首先将实验侧粘骨膜与骨面剥离分开，把未发生形变的牵张器放置于骨面并作充分贴合，钛合金固位钉固定后将切开处粘骨膜对位缝合，用热盐水纱布敷于牵张器处黏骨膜表面，使其温度升高发生形变，此时骨膜与腭骨骨面之间出现间隙，即刻产生骨膜牵张力。

1．4 动物处理 根据实验动物分组，分别在牵张器成功放置20、30、40、60 d 后处死实验动物，在处死动物前倒数第14天和第3天对所有实验动物进行肌肉注射四环素，四环素用量按每公斤体重注射50 mg计算。切取腭裂家犬实验侧与自身对照侧裂隙缘骨组织以及空白对照组腭部骨组织，骨组织块经过石蜡包埋后，利用硬组织骨切片技术对骨组织进行沿骨膜垂直方位切片，以备四环素荧光染色观察新骨生成的动态过程。

1．5 观察方法及测量 在Leica荧光显微镜(波长为360～400 nm)下观察腭部骨组织四环素荧光切片并拍摄照片。用LEICA图象分析系统(CW4000 FISH)来进行骨组织计量学动态参数测量分析，为减少测量误差获得可靠的实验数据，对每一实验组标本共选取5处视野，测量荧光双标记线间平均距离(SBDTL)和新生骨组织矿化沉积速率的平均值(MMAR)，严格按照完全随机的原则收集整理所有实验数据。

1．6统计学分析 采用统计软件SPSS13．0进行分析，经正态性和方差齐性检验后行方差分析，组间比较方差齐时采用LSD法，方差不齐时采用Gunnett＇T3 法，以 P ＜0.05 认为有差异。

2 结果

2．1 四环素荧光标记观察 骨膜牵张20 d后与对照组比较显示:靠近裂隙边缘处可观察到少量早期形成的骨组织，其最外缘可见薄层的类骨质，但荧光带显示较弱，连续性差，且排列紊乱，未见荧光双标记线。骨膜牵张30 d后比较显示:裂隙边缘处生成新骨量较牵张20 d组增多，类骨质增厚，荧光带明显且排列较规整，连续均匀，并可见荧光双标记线，但间距较窄。骨膜牵张40 d后比较显示:牵张区见大量成骨细胞，成骨活动活跃，且骨小梁排列整齐，排列方向与表面骨膜相垂直，靠近骨膜表面处可见荧光双标记线显示清晰，但成环不全。裂隙边缘处新形成骨组织的髓腔较大，骨小梁内侧边缘荧光双标记线间距较宽。骨膜牵张60 d后比较显示:骨小梁排列整齐且粗壮，骨小梁表面双线形荧光带显著，双线间距明显增宽，且成环。在新骨边缘及骨陷窝处均可观察到荧光带，骨质表现成熟(见图1)。

2．2 骨组织形态计量学动态参数测量分析结果自身对照侧在靠近腭部裂隙缘处未见四环素荧光双标线形成，仅见少量散在荧光带分布。在骨膜牵张成骨不同时期，实验组各组间荧光双标线间距及平均矿化沉积速率比较显示，组间差异均有非常显著意义(P＜0．01)(见表1)。

表1 四环素双标间距和平均矿化沉积率各自在腭骨骨膜牵张不同时期的比较

图1 裂隙缘骨组织四环素标记×100

3 讨论

腭裂的骨性修复一直是个难题，由于是包括骨组织、口鼻腔粘膜的全层组织缺损，即使不考虑取骨处的二次损伤及骨吸收问题，软组织不足问题就使植骨术在腭裂修复治疗中无法顺利进行。近年来腭裂治疗理论更多关注于术前矫正上，牙槽矫正器械就是通过缓慢加力的方式使牙槽嵴裂隙减小甚至关闭［5］，当手术修复时往往不需要行髂骨松质骨移植术，只需行牙龈下骨成形术即可。这是颌面部裂隙畸形治疗方式的重大突破，但这种方法却无法关闭腭部的软硬组织裂隙。Abramo A C［6］曾试图在术前及术中通过扩展腭部的方式使软组织量增加，以此达到腭部无张力缝合的目的，在一定程度上可以降低腭瘘、腭咽闭合不全的发生率，同时也可能对上颌骨发育影响减小。但这种方法同样无法对腭部硬组织进行修复，致使短期效果尚可，而长期效果还有待观察。梁立民等［7］报道了骨缝牵引成骨封闭硬腭裂隙实验研究及初步临床应用，但此方法在适应证上有一定限制，不能应用于骨缝已发育完成的成年人，同时这种方法并发症的发生如面宽度和腭骨段呼吸道宽度发育不足也见有报道［8］，因此骨外膜牵张成骨应运而生。

骨组织是一种能不断再生与吸收的有机器官，这便可以依靠细胞活力与生物力学来重塑骨形态，Ilizarov［9］证实稳定的牵张力作用于活体组织后可以刺激并维持某些组织结构如骨组织的再生，随后成功将长骨的牵引成骨技术应用于临床。近来国内外进一步将牵张成骨技术应用于颌面部，同样也可以诱导新骨形成，而且在新生骨中未见软骨或纤维软骨，成骨方式为骨膜下成骨。近十年来PDO更多的应用于颅颌面缺损畸形，其成骨原理是当骨膜被缓慢牵张后，可以刺激新骨的形成。Kostopoulos［10］将四氟乙烯材料的囊状物固定于大鼠下颌支皮质骨表面，观察到了一定数量的新生骨组织形成。Schmidt［11］等以3 mm/d的牵张速度在牵张器置于家兔下颌支骨膜下第28、35、42、56天进行牵张成骨，最后获得约2．86 mm高度的新生骨，进一步证实了PDO治疗颌面部骨质缺损的可行性，并强调PDO避免了牵张成骨术中的截骨术或皮质骨切开术，尽可能的降低了损伤程度。腭裂骨缺损修复的同时，粘膜与肌肉也可以得到扩张，其他较以往修复方法的优势如:①牵引方向可为中间与后方，关闭裂隙的同时也延长了硬腭长度;②镍钛记忆合金装置可以提供持续的牵张力，而且便于临床操作，减轻了工作量;③特制的牵张装置适合安装于薄弱的、不平坦的腭骨表面;④对于错过早期治疗的大龄儿童，这种方式也较适合。因此，这项技术临床应用前景极为广阔。

四环素类药物与骨组织有很强的结合力，在骨内膜、骨外膜等成骨活跃的部位较易沉积，沉积在骨内的四环素在紫外线照射激发下产生荧光，从而标示新生骨的分布区域与结构特点，可作为骨生成情况的动态观察指［12］。本实验通过四环素双标记的方法，把时间因素标记在骨膜牵张成骨过程中，在牵张器放置20 d后可见牵张区内出现排列紊乱、不连续的荧光带，表明开始有成骨活动。在牵张器放置30 d后牵张区成骨活动活跃，出现排列规整、连续均匀的高亮度荧光带。在牵张器放置40 d后牵张区成骨活动更加活跃，荧光带主要分布在长轴沿牵张力作用方向的大量新生平行骨小梁表面。由于新骨生成是由裂隙缘处向中央的纤维组织发展，因此，不同部位的新骨组织成熟度也不相同。在靠近原骨切口线界面早期形成的新骨组织内，可见荧光失去连续性，说明为适应正常生理可能的需要，骨小梁开始改建并逐步转变为与应力负荷相适应的交织结构。在牵张器放置60 d后，牵张区较为成熟的骨组织继续沉积钙化，而晚近形成的骨小梁的沉积成熟与改建过程同时进行。四环素荧光标记法研究的结果与前期实验PDO新生骨质组织学特征的观察结果相符。

腭裂牵张成骨多采用自行设计的牵张器，牵张装置样式繁多，随着骨膜牵张成骨的研究，逐渐出现牵张装置不稳定而引起的一系列并发症如牵张器移位影响成骨效果、牵张装置部分暴露造成继发感染进而导致失败［13］，本实验采用的是内置式的镍钛记忆合金牵张器，组织相容性好，同时制作简单，操作方便，钛合金固位钉固位于牵张器的固定端，保证了牵张过程的稳固，这是牵张成骨成功的关键。相对于半置入式或外置式牵张器，内置式牵张器全埋伏于骨膜下且保证骨膜无损伤可减少感染几率，牵张装置小型化也可以减少异物感，有利于功能活动，尽量避免影响正常生活质量。不同于以往牵张器，牵张速度及频率需手动调节，效果的好坏很大程度上取决于患者的依从性，镍钛记忆合金低温下形变，随着置入体内环境后温度上升，无需外力加载就可以对骨膜产生持续稳定的牵张力，从生理上更符合骨组织生长要求。同时牵张过程无需延迟期、牵张期、固定期［14，15］等步骤，保证成骨质量的同时也大大简化了成骨过程。

原发性唇腭裂实验动物模型现已较成熟的应用于小鼠［16，17］，是用具致畸作用的诱导剂如糖皮质激素类及维生素A类等药物诱导建立的，也主要用于病因学和发病机理研究。本实验采用健康家犬经手术切除部分硬腭组织建立人工腭裂模型，由于犬口裂大，有利于手术及术后观察，模型建立2月后未见裂隙关闭并开始进行持续的骨膜牵张，四环素荧光标记示成骨过程稳定为进一步应用临床提供基础。但人工腭裂模型的解剖结构与先天性腭裂有一定差别，这有待于进一步实验来验证其成骨差异。

本研究设计的骨膜牵张成骨技术是一种以局部自身新生软硬组织的增生为基础，在修复腭裂缺损软硬组织的前提下，关闭裂隙的功能性腭裂整复术，开拓了腭裂治疗的新途径，为临床应用提供了理论和实验依据。

［1］Schmidt B，Kung L，Jones C，et al．Induced osteogenesis by periosteal distraction［J］．J Oral Maxillofac Surg 2002，60:1170－1175．

［2］Kaban L B，Thurmuller P，Troulis M J，et al．Correlation of biomechanical stiffness with plain radiographic and ultrasound data in an experimental mandibular distraction wound［J］．Int J Oral Maxillofac Surg，2003，32;296 －304．

［3］Zimmermann C E，Thurmuller P，Troulis M J，et al．Histology of the porcine mandibular distraction wound［J］．Int JOral Maxillofac Surg，2005，34:411 －419．

［4］宋庆高，邓金勇，陈尚，等．腭裂缘骨膜牵张成骨不同阶段的组织学变化分析［J］．国际口腔医学杂志，2011，38(2):141－144．

［5］Millard D R，Latham R，Huifen X．Cleft lip and palate treated by presurgical orthopedics，gingivoperiosteoplasty，and lip adhesion adhesion method:a preliminary study of serial dental casts［J］．Plast Reconstr Surg，1999，103:1630 －1644．

［6］Abramo A C，Viola J C，Angelo A J．Intraoperative rapid expansion in cleft palate repair［J］．Plast Reconstr Surg．1993;91:441－445．

［7］梁立民，柳春明，熊军，等．牵引成骨修复人工腭裂的远期效果和对颌面部的影响［J］．中华整形外科杂志，2003，19(6):441 －444．

［8］柳春明，宋儒耀，宋业光．腭骨外侧缝牵张成骨关闭硬腭裂的长期效果和对颌面发育影响的实验研究［J］．中华整形烧伤外科杂志，2000，21(2):357－360．

［9］Ilizarov G A．The tension－stress effect on the genesis and growth of tissues．Part I．The influence of stability of fixation and softtissue preservation［J］．Clin Orthop Relat Res，1989，238:249 －281．

［10］Kostopoulos L，Karring T．Role of periosteum in the formation of jaw bone:an experiment in the rat［J］．J Clin Periodontol，1995，22:247 – 254．

［11］Schmidt B，Kung L，Jones C，et al．Induced osteogenesis by periosteal distraction［J］．J Oral Maxillofac Surg，2002，60:1170 －1175．

［12］Ow A，Cheng L K．Bilateral sagital split osteotomies and mandibular distraction osteogenesis:a randomized controlled trial comparing skeletal stability［J］．Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2010，109:17 －23．

［13］Estrada J I，Saulacic N，Vazquez L，et al．Br J Oral MaxillofacSurg，2007，45(5):402 － 405．

［14］Ilizarov G A．The tension － stress effect on the genesis and growth of tissues:Part II．The influence of the rate and frequency of distraction［J］．Clin Orthop Relat Res，1989，239:263 －285．

［15］Antoniades K，Economou L，Sioga A，et al．Pathogenesis of bromo2 deoxyuridine2induced cleft palate in mice1［J］．J Craniomaxillo2facial Surg，1995，23:252 －255．

［16］Abbott B D，Harris M W，Birnbaum LS1 Comparisons of the effects of TCDD and hydrocortisone on growth factor expression provide insight into their interaction in the embryonic mouse［J］．palate1 Teratology，1992，45:35 －53．

［17］Jurand A，Martin LV1．Cleft palate and open eyelids inducing activity of lorazepam and the effect of flumazenil［J］．the benzodiazepine antagonist1 Pharmacol Toxicol，1994，74:228 －235．